2023年全国硕士研究生考试考研英语一试题真题(含答案详解+作文范文)_第1页
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文档简介

1、昆虫泌丝是我们生活中非常常见的现象,如蜘蛛结网,昆虫结茧,蜜蜂筑巢等泌丝行为都具有独特的生物学意义。但在众多的泌丝昆虫中,家蚕经进化获得了强大产丝能力,加上4000多年的人工驯化,使家蚕成为迄今为止吐丝能力最强的昆虫之一。家蚕一生食下20g桑叶,其丝腺可分泌0.5g茧丝。丝蛋白主要由三种丝素蛋白和三种丝胶蛋白组成,其中含量最高的丝素重链蛋白Fib-H占总茧丝量的70%,所以一头蚕可以合成并分泌0.35g的丝素重链蛋白。转录组数据分析发现

2、,Fib-H基因mRNA占总mRNA的19.3-54.5%。一个基因的表达量如此之高在自然界中也是非常罕见的。研究发现调控 Fib-H基因表达的两种可能的机制:后部丝腺细胞核内复制形成超级多倍体细胞;多种转录因子协同调控其精细的时空特异性表达。但两种因素并不能完全解释丝蛋白的高量表达,是否存在其他调控方式呢?早期日本学者发现 Fib-H基因表达和不表达时其基因区域染色体状态不同。随着基因组研究技术的发展和对染色体结构认识水平的提高,染色

3、体状态不同是由染色体的空间结构变化导致的并参与了基因的表达调控。研究染色体的空间结构的主要方法是染色体构象捕获技术及其衍生技术。那么染色体的构象是否参与Fib-H基因表达调控的问题依然不清楚。本文利用染色体构象捕获技术获取家蚕全基因组染色体互作图谱,并从染色体互作图谱中分析Fib-H基因区域染色体构象,推测基因组三维空间结构对Fib-H基因表达调控的影响,并通过CRISPR/Cas9特异性编辑后部丝腺的核纤层蛋白基因破坏染色体构象来研究

4、染色体结构变化对Fib-H蛋白表达的影响。取得的主要研究结果如下:
  1.获得家蚕 BmE细胞系及不同时期丝腺组织的全基因组染色体互作图谱与三维基因组模型
  利用基于高通量测序的染色体构象捕获技术(HiC)构建文库,经测序、分析得到了BmE细胞系(BmE)、4龄眠期后部丝腺(4M-PSG)、5龄3天中部丝腺中部(5L3-MMSG)、5龄3天中部丝腺后部(5L3-PMSG)、5龄3天后部丝腺(5L3-PSG)及预蛹1天后部

5、丝腺(PP1-PSG)的全基因组染色体互作图谱,结果显示,细胞系和组织(丝腺)均表现为染色体内的相互作用频率高,染色体间的相互作用频率低,说明家蚕细胞的染色体倾向于分布在细胞核内相对独立的区域形成染色体疆域。染色体间的相互作用以反式互作图谱形式展示。在BmE细胞系的反式互作图谱中,Chr5、Chr13、Chr22间互作频率高,由于染色体间的互作图谱中染色体之间的互作频率间接反映染色体在细胞内的空间分布,所以推测3条染色体在BmE细胞群体

6、细胞核中位于空间上相对较近的位置。5L3-PSG的Chr11与Chr14间的互作频率高,4M-PSG无互作频率较高的的染色体,5L3-MMSG和5L3-PMSG组织中的Chr8与Chr24有较高互作频率,PP1-PSG的Chr7与Chr22,Ch4与Chr7间的互作频率高,推测这些互作频率高的染色体在空间上更加靠近。根据染色体构象捕获数据模拟出细胞内基因组三维结构,主要有两种形式:BmE细胞系相对同质化,染色体间互作频率较高;丝腺组织相

7、对异质化,染色体内互作频率较高。
  2.家蚕染色体互作图谱中的区室化(Compartment)与拓扑相关区域(Topologically associated domain, TAD)分析
  分析显示染色体内的互作是家蚕细胞内最主要互作模式。染色体内各位点之间的相互作用称为顺式相互作用,顺式互作图谱的主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是染色体区室(compartment)划分的

8、依据,以染色体互作图谱的形式展示。家蚕BmE细胞及组织样本的染色体互作图谱显示,家蚕基因组相互作用存在相对更小的染色体互作区域——染色体区室,而染色体区室具有细胞类型特异性并且与染色质的开放与封闭有关。家蚕BmE细胞染色体区室较明显,一般将染色体分为1-6个区室。组织样品的染色体区室化更加复杂,主成分分析中第一特征向量并不能很好反映染色体区室,需要结合第二特征向量进行分析,且各染色体之间的差异非常大。有些染色体只有一个染色体区室,说明整

9、条染色体均分布于这个区室,染色体状态较为相近。而有些染色体可分成多个区室,说明染色体的不同区段位不同的区室,染色体的状态随着区室的变化而变化。丝腺组织样品间的染色体区室差别较大,由于不同时期及不同部位的丝腺细胞在功能上存在差异,所以染色体特异的区室为细胞在特定时空下实现其功能提供了必要的环境。如果两种组织功能差异非常大,其染色体区室也会相应的发生变化。染色体内更小层级的功能性互作模式为TAD,TAD位点间相互作用频率非常高,但TAD外的

10、区域即使在线性距离上靠近,相互作用频率也非常低。家蚕细胞与组织的TAD分析显示,BmE细胞系的TAD大小为100kb~1Mb,而组织样品中既含有较小的TAD,也包含较大的TAD,分布范围为0.1Mb~2Mb。这与TAD的功能性有关,TAD为相互作用的基因提供微环境保证基因表达调控更加的精准,多在基因的增强子-启动子区域调控基因表达。较小的TAD负责执行基因本底表达,相对保守,而大的TAD实现基因的调控表达,具有组织时期特异性。
 

11、 3.5龄3天后部丝腺中三条染色体具有特殊的互作模式
  根据全基因组染色体互作图谱分析发现5L3-PSG的Chr11、Chr24和Chr25三条染色体内的相互作用具有特殊的染色体互作模式,即一段区域将染色体分成两个相对独立的互作频率很高的染色体区域,而两个区域之间的互作频率很低。将Chr11分成两部分的区域为Chr11:4,100,000~4,300,000,此区域内并未注释到编码基因;将Chr24分成两部分的区域为Chr24:

12、14,600,000~15,000,000,家蚕基因组精细图谱中为gap区;Chr25的间隔区域为Chr25:11,700,000~11,900,000,此区域内只有Fib-H基因。分析发现编码三个丝胶蛋白的基因均位于Chr11,Sericin1位于较小的染色体互作区域,而Sericin2、sericin3位于较大的另一区域。Chr24不含有丝蛋白基因所以并未深入分析。丝胶蛋白基因与丝素蛋白基因在家蚕中超高量表达形成茧壳,两类蛋白占茧壳

13、总量的75%。染色体内特殊的互作模式是否参与调控丝蛋白基因的高量表达,目前仍不清楚。为了鉴定染色体的结构与丝蛋白高量表达之间的关系,本研究分析了不同时期与部位的丝腺组织材料(4M-PSG、5L3-MMSG、5L3-PMSG、PP1-PSG)的染色体相互作用,结果显示所有样品中Chr11均出现特殊的染色体结构,而Chr25号染色体仅在5L3-PSG样品中表现出特殊的染色体互作模式。5L3-MMSG与5L3-PMSG其它染色体间相互作用基本

14、一致,4M-PSG与5L3-PSG中其它染色体间相互作用相近。虽然PP1-PSG为后部丝腺材料,因丝蛋白表达已经结束并进入预蛹期准备化蛹,其染色体结构与其它4个样品差异较大,说明染色体的结构与功能的一致性。5个组织样品中Chr25的差异较大,且分隔区域为Fib-H基因,两者之间主要表现在Fib-H基因的表达活性上。Fib-H基因在5L3-PSG中具有表达活性,在4M-PSG中暂时无表达活性,在PP1-PSG中失去表达活性,在5L3-MM

15、SG、5L3-PMSG中永久性无表达活性。Chr25特殊互作模式的出现与 Fib-H基因高量表达均具有组织时期特异性。此结果与1993年Waga等检测4眠与5龄期后部丝腺以及5龄中部丝腺时发现Fib-H基因区域的5’上游、增强子-启动子区域和主要的蛋白编码区域的DNaseI敏感性具有明显差异,即染色体结构差异的结果一致[1]。推测Chr25染色体相互作用模式的差异暗示着这可能参与Fib-H基因的表达调控。相比Chr25的差异,Chr11

16、在所有样品中均表现出特殊的染色体互作模式。分析发现5个样品存在细微的差异,仅在5L3-MMSG、5L3-PMSG中三个丝胶蛋白基因位点之间存在明显的相互作用。所以推测 Chr11的特殊染色体互作模式不具有组织时期特异性,但丝胶蛋白基因之间的染色体互作具有组织特异性。
  4.利用CRISPR/Cas9技术初步探索3D基因组结构对丝腺中基因表达的影响
  Chr25在5龄3天后部丝腺中的特殊染色体构象是否对Fib-H基因表达起

17、调控作用仍不清楚。因此本研究通过基因编辑改变维持染色体构象的方法,研究其对Fib-H基因表达的影响。
  核纤层蛋白在细胞核形态维持与核内染色体分布的过程中起着重要作用,核纤层蛋白的缺失会导致细胞核内染色体分布的紊乱从而改变细胞核内基因组三维空间上的互作。核纤层蛋白在多个物种中高度保守,参考家蚕全长cDNA文库中鉴定的laminC-like的序列[2],经TA克隆测序验证开放阅读框(ORF),它与文库中的序列一致,将laminC-

18、like基因命名为BmlaminA/C。鉴定的BmlaminA/C基因全长为15111bp,包含10个外显子与9个内含子,mRNA全长3262bp,ORF编码620个氨基酸,含有两个保守结构域。定量PCR检测BmlaminA/C基因的组织达谱,结果显示BmlaminA/C基因在5龄3天的头部、脂肪体、马氏管、中肠、丝腺及生殖腺组织中均有表达。近年来本实验室先后采用ZFN、TALEN与CRISPR/Cas9基因编辑系统实现了家蚕基因编辑,

19、三种方法均通过胚胎注射瞬时表达的人工核酸酶的mRNA或质粒,筛选可遗传的突变后代获取转基因个体。瞬时编辑方法对胚胎致死基因或发育调控基因的编辑存在较大限制。而BmlaminA/C基因编码重要的结构蛋白,全身敲除会严重影响家蚕生长发育,无法研究染色体结构变化对丝蛋白合成的影响,所以需要构建组织特异性基因编辑系统。本研究首先构建了高效靶位点筛选系统,利用此系统确定靶位点的突变效率,筛选用于个体基因编辑的高效率位点。随后分别构建在后部丝腺特异

20、性表达Cas9的转基因家蚕,全身性表达靶向gRNA的转基因品系,杂交后筛选转基因标记,得到组织特异的靶基因编辑突变个体。根据上述策略得到了后部丝腺特异性表达Cas9转基因品系以及全身性表达靶向编辑BmlaminA/C基因的gRNA转基因品系,杂交后共获得2个后部丝腺特异靶向编辑BmlaminA/C基因的转基因系。检测显示基因组水平上BmlaminA/C基因靶位点100%突变,mRNA下调43.7%-74.3%,蛋白表达量下降了83%-9

21、1%。2个转基因品系中BmLaminA/C蛋白的表达量下调,丝蛋白合成能力均受到影响,茧层率显著下降,其中一个品种有部分幼虫甚至不能吐丝结茧。转基因个体中后部丝腺细胞数无明显变化,但丝腺细胞排列紊乱,丝腺变短,丝腺腔变大中空,表型与 Fib-H基因敲除(本实验室前期研究)的转基因个体相似。荧光定量PCR结果显示后部丝腺中主要丝素蛋白基因表达量下调。转录组数据分析显示,Fib-H基因表达量从总TPM值的20%下降到10%,表明突变体中基因

22、组结构的变化对Fib-H基因的影响最大。根据以上结果推断染色体的三维结构调控FibH基因的表达。
  综合以上研究结果,本研究利用HiC染色体构象捕获方法获得家蚕细胞及组织的全基因组染色体互作图谱,并对染色体构象参与丝蛋白表达调控进行了初步的分析。结果显示,Chr25特殊的染色体互作模式的出现与Fib-H基因的表达均具有组织时期特异性,暗示前者对后者存在调控作用;利用基因编辑技术实现后部丝腺染色体结构的扰乱,丝蛋白的表达量明显下调

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