家蚕核型多角体病毒Bm41和Bm51基因分析.pdf

1、到目前为止，有48种昆虫杆状病毒的基因组被完全测序，而家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucloepolyhedrivirus，BmNPV)作为杆状病毒的模式病毒之一，得到了越来越广泛的研究和应用.目前，有许多基因的功能已了解清楚，例如Bm67、Bm56、Bm9等，但仍有许多基因的功能尚是未知。本研究中，选取了orf41和orf51两个功能未知基因为研究对象，从基因的转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位、基因缺失等方面研究基因的

2、基本特性及其初步功能，从而丰富杆状病毒分子生物学理论，并为下一步深入分析基因功能和相关病毒基因工程研究提供基础。 本研究的主要结论如下： 1.BmNPVorf41(Bm41)基因分析Bm41位于BmNPV(T3株)基因组39204-39788nt，读码框全长585bp，编码194个氨基酸，预测分子量约为23.3kDa.在Bm41起始密码子ATG上游146nt处有一杆状病毒晚期转录基序CAGT。用BLASTP工具搜索Gen

3、Bank和SWISS-PROT数据库发现，在25种目前已经测序的鳞翅目基因组中存在Bm41的同源序列，包括GroupINPV和GroupIINPV，但在于鳞翅目GVs和其它杆状病毒并未发现。因而推测，Bm41及它的同源基因是鳞翅目昆虫核型多角体病毒特有基因，在其它杆状病毒寄主系统中，这个基因可能是非必需的或细胞内因子可以补偿这种缺陷。 为了进一步研究Bm41在病毒侵染循环中的作用，利用ET重组系统成功构建了Bm41的突变病毒，进

4、而利用Bac-to-Bac系统构建了一个在多角体位点重新补回Bm41的补回病毒，电镜分析表明，敲除Bm41影响了病毒核衣壳的形成以至进一步影响了成熟的ODV形成多角体。Westernblot分析表明，Bm41既不是ODV也不是BV的结构蛋白的组成部分。细胞内定位表明，Bm41可能在细胞核和细胞质均有功能。转录和表达时相表明Bm41是一个早期转录的基因。用突变的病毒感染细胞样品进行westernblot分析表明，一些晚期基因的表达受到了影

5、响，ODV-EC27的表达受到了明显的下调，多角体基因的表达则受到了抑制，不再表达。 生物测定分析表明，与突变前野生病毒相比，突变的Bm41病毒延长了宿主昆虫的LT50，也提高了宿主昆虫的LD50。BV滴度分析表明，Bm41的突变大大降低了BV在细胞内的产量。 综上所述，BmNPVorf41是一个早期基因，编码的蛋白与结构蛋白无关。Bm41的突变影响了病毒DNA复制并在细胞和虫体内产生了很低产量的BV。而且，Bm41缺少

6、的病毒对宿主昆虫的感染力降低并延长了对宿主昆虫的致死时间。电镜分析表明，Bm41的突变影响了核衣壳的形成。因此推测，Bm41尽管不是病毒复制的必需基因，但是在BV和ODV形成方面均起着重要作用，且是影响病毒在体内和体外感染力的重要基因。 2.BnNPVorf51(Bm51)基因分析Bm51位于BmNPV(T3株)基因组45935-46402nt，读码框全长468bp，编码一个长155个氨基酸残基的蛋白，预测分子量为18.5kDa

7、。在Bm51起始密码子ATG上游26nt处有1个杆状病毒晚期转录基序CAGT。RT-PCR分析表明，Bm51在4.5hp.i.开始转录。利用大肠杆菌表达系统表达了GST-Bm51融合蛋白并利用该蛋白制备了多克隆抗血清。利用此抗血清进行Bm51的表达时相分析发现，Bm51的表达产物在6hp.i.被检测出来。以上试验结果表明，Bm51是一个杆状病毒早期表达基因。 利用抗Bm51的特异性抗体，对提取纯化的BV和ODV进行了wester

8、nblot分析，在提纯的BV泳道中出现了的23kDa阳性条带。在ODV中没有检测出阳性条带。因此Bm51蛋白是BV特异性的结构蛋白。为了精确确定Bm51在BV中的定位。进一步将BV分离为BV核衣壳蛋白(BV-NC)和BV囊膜蛋白(BV-E)。利用Bm51抗体去杂交BV-NC和BV-E，发现只能在BV囊膜蛋白(BV-E)上杂交到阳性条带，而在BV-NC并没有任何条带。说明Bm51基因编码了与BV核衣壳相关的结构蛋白。 为了对Bm5