斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的特性分析.pdf

1、斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ(Spodoptera litura multicapsidNucleopolyhedrovirusⅡ,SpltMNPVⅡ)是一种繁殖率和毒力极强的新型昆虫杆状病毒,其基因组全序列已测定,在其编码的149个ORFs中,一些基因的功能已被阐明,但还有许多基因的功能尚不清楚。ORF56是其中一个功能未知的重要基因,本研究以SpltMNPVⅡORF56为研究对象,在对其进行序列分析、克隆表达及多抗制备的基础上,进一步从

2、基因的转录、表达、结构定位、基因缺失等方面,研究该基因的基本特性及其功能,旨在丰富杆状病毒的分子生物学信息。论文主要成果如下:
　　 1、利用生物信息学软件对SpltMNPVⅡ ORF56基因进行了序列分析。ORF56基因位于基因组54166～54840 bp,全长675 bp,编码一个含224个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为25.9 kD。序列分析显示,在ORF56基因ATG上游存在杆状病毒晚期转录基序GTAAG,在终止密码

3、子TAA下游发现转录终止信号AATAAA；推导的氨基酸序列中含有13个磷酸化位点、3个N-糖基化位点、1个Bromodomain结构域和1个TFS2N基序。同源比对发现,ORF56是一个保守性很强的蛋白,在47种杆状病毒基因组里都能找到其同源基因。
　　 2、利用大肠杆菌表达系统表达了ORF56融合蛋白并制备了多克隆抗体。首先根据ORF56基因序列设计引物,以SpltMNPVⅡ基因组DNA为模板进行PCR扩增,将得到的基因克隆至

4、原核表达载体pET32a(+),在原核细胞中实现了基因的融合表达。用割胶回收纯化的蛋白疫新西兰大白兔,制备了ORF56蛋白的多克隆抗体。
　　 3、RT-PCR定性分析和Real-time PCR定量分析结果均表明,ORF56基因从病毒感染后12 h开始转录,一直持续到72 h,可能是一个晚期基因。利用自制的抗体进行表达时相分析发现,ORF56的表达产物在病毒感染宿主细胞后24 h被检测出来,一直持续72 h都有表达,大小约为2

5、6.0 kD,与预测的大小一致,推测ORF56是一个晚期表达基因,并且没有发生明显的转录后修饰。利用Western blot方法检测分离出的BV、ODV粒子,结果发现ORF56在两种病毒粒子都能检测到。
　　 4、构建了以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因为标记的、ORF56缺失的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒。分别扩增出ORF56读码框上下游的不同片段及多角体启动子启动的egfp,将三个片段按顺序克隆进pUC19载体,构建了转移载

6、体pAORF56-egfp。将p△ORF56-egfp与野生型SpltMNPVⅡ DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和空斑筛选的方法,获得了以egfp基因替代ORF56的缺失重组病毒SpltMNPVⅡ-△ORF56-egfp,并在细胞水平上进行了对ORF56基因的功能进行了初步分析。用SpltMNPVⅡ-△ORF56-egfp感染Spli细胞后的复制结果显示,ORF56的敲除并不影响病毒在细胞水平上的增殖和复制,说明ORF56可能是