家蚕转绿色荧光蛋白-蜘蛛丝蛋白融合基因的研究.pdf

1、为了改善蚕丝的机械性，本研究以piggyBac转座子载体为骨架，构建了含有家蚕丝素重链蛋白的N-端区域(NTD)-绿色荧光蛋白(eGFP)-蜘蛛丝蛋白[A2S8]28-重链蛋白的C-端区域(CTD)融合基因表达元件的打靶载体pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD，同时根据丝素重链基因内含子区域((AF226688:63011-63025和63052-63066)的DNA序列，设计组装了TALENs序列，构建了靶向丝素重链基因内含

2、子区域的TALEN9-10载体；SURVEYOR和 lacZ中断法证实 TALEN9-10载体在家蚕卵母细胞株(BmN cells)中的效率约为13.95％。将TALEN9-10载体与打靶载体pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD混合，通过真空电穿孔技术，导入家蚕初产卵，筛选获得G0代转基因家蚕。PCR检测结果显示，G0代转基因家蚕蚕蛾基因组中有报告基因eGFP(e nha nce gree n fluo resce nce p

3、 rote in ge ne)的存在；Western Dot Blot检测转基因家蚕蚕茧蛋白样品，证实转基因家蚕表达了家蚕丝素重链蛋白的N-端区域(NTD)-绿色荧光蛋白(eGFP)-蜘蛛丝蛋白[A2S8]28Spider-重链蛋白的C-端区域(NTD)融合基因；ELISA定量检测显示，eGFP在转基因家蚕蚕茧蛋白可溶样品中的含量约为4%(摩尔比)，推测表达的蜘蛛丝蛋白Spider[A2S8]28在可溶样品中的摩尔比含量也为约4%。外源

4、DNA在家蚕基因组的定位分析显示，外源DNA定位于家蚕基因组的23号染色体，打靶载体在转基因家蚕基因组中的整合方式为随机插入，并非由TALEN技术介导的定点插入；机械性能检测结果显示，G0代转基因家蚕蚕丝的最大极限拉力(Ma x.Stre ss)提高了约40-50%，最高的最大极限拉力约为700MPa,平均值约为620MPa。挑取G0代茧丝最大极限拉力(Ma x.Stres s)最高的转基因蚕杂交传代，得到G1代转蛛丝基因家蚕，检测结果