家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖复制关键基因的筛选与鉴定.pdf

1、家蚕作为具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫，在世界的文化传播、经济和社会的发展中发挥了重要作用。然而每年因蚕病引起的损失占蚕业总生产的比例高达25％。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus，BmNPV）是蚕业上危害最严重且最常见的一类病原微生物。随着1999年对BmNPV全基因组序列测定的完成，BmNPV的侵染增殖分子机制的研究逐渐深入。本研究利用家蚕内源性的microRNA骨架，采用RNA

2、i技术，筛选及鉴定BmNPV增殖复制的关键基因。主要研究结果如下:
　　1.BmNPV增殖复制相关基因的筛选与克隆
　　根据文献报道的杆状病毒基因功能分析，初步筛选与BmNPV增殖复制相关的34个基因进行克隆。其中参与病毒DNA复制的基因有9个，参与病毒BV产生的基因有28个，与核衣壳产生相关的基因有12个，影响晚期基因表达的基因有8个，影响极晚期基因表达的基因有7个。
　　2.BmNPV增殖复制关键基因的鉴定

3、　　从已初步筛选的34个基因中最终筛选8个候选基因作为后续实验的研究对象。这8个基因分别是:dbp、lef2、lef3、lef7、lef10、lef11、p143、vp1054。分别构建这8个基因对应的干涉载体和荧光素酶载体，转染BmN-SWU1细胞。转染细胞48h后测酶活，发现lef2和lef11的抑制效果达到90％以上，dbp、lef3、p143、vp1054抑制效果达到80％以上，而lef10抑制效果只有12.4％，lef7没有抑

4、制效果。在病毒的感染率统计实验中，pIZ-DsRed-milefl1转染的细胞中病毒的感染率仅为9.16％，pIZ-DsRed-milef10病毒感染率为26.2％，pIZ-DsRed-midbp、pIZ-DsRed-milef3病毒感染率分别为58.4％和54.6％，pIZ-DsRed-mip143和pIZ-DsRed-mivp1054病毒感染率分别是71.1％和67.3％，而pIZ-DsRed-milef2，pIZ-DsRed-mi

5、lef7感染率达到了100％。以上结果表明在本研究所筛选的8个候选基因，lef11是BmNPV增殖复制的关键基因。
　　3.不同启动子驱动的同一干涉载体对病毒增殖复制的影响
　　将筛选的7个活性不同的启动子A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70分别替换pIZ-DsRed-milef11中的IE2启动子，并将构建的干涉载体转染BmN-SWU1细胞，转染细胞48h后测酶活。A4、IE1、IE

6、1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70干涉载体对lef11基因的抑制效果分别是92.6％、97.9％、96.9％、94.8％、95.3％、96.8％、97.9％。在病毒的感染率统计实验中，A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70干涉载体转染的细胞中，病毒的感染率分别是18.1％、8.34％、8.41％、11.1％、11.9％、12.1％和11.8％。干涉效果以及对病毒增殖复制的影响