灵菌红素抑制家蚕核型多角体病毒BmNPV核酸复制和基因表达的q-PCR分析.pdf

1、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）属于杆状病毒科的一种环状双链超螺旋 DNA(dsDNA)病毒。根据感染进程的不同，BmNPV呈现出两种不同的病毒粒子表型，即芽殖病毒(budded virus，BV)和包涵体病毒(ODV)。BV依赖囊膜融合蛋白GP64引起细胞间的感染，而ODV形成于感染晚期，包埋于稳定的蛋白结晶体中，主要造成家蚕个体间的感染。BmNPV病毒基因的表达以DNA的复制为界限可分为两个时期，即早期和晚期，分别又可细分为极早期、

2、早期、晚期和极晚期。研究显示，极早期基因ie-1、晚期基因vp39和极晚期基因p10可以被用作marker基因来评估BmNPV的增殖过程。灵菌红素是具有三个吡咯环的微生物次生代谢产物，具有多种生物学活性。本实验室前期的研究发现灵菌红素具抑制 BmNPV增殖的作用。本研究以此为出发点，进一步论证灵菌红素的抗 BmNPV病毒活性。
　　本研究主要内容包括：⑴收集病毒感染72h后的培养基上清，采用空斑法测定BmNPV子代病毒滴度。结果显

3、示，灵菌红素能显著地抑制子代病毒BV的产生。对照组子代病毒BV的产生量显著高于灵菌红素处理组，分别为100 nM灵菌红素处理组和10 nM灵菌红素处理组BV产生量的105和103倍。通过显微计数的方法计算形成包涵体OB的细胞数。统计结果显示，灵菌红素能够影响病毒包涵体在细胞中的形成。随着灵菌红素浓度的增加，形成包涵体的细胞数逐渐减少，当灵菌红素浓度为100nM时，细胞中形成包涵体的细胞数仅为4.45％。⑵利用q-PCR检测灵菌红素对病毒

4、基因组DNA复制的影响。实验结果表明，随着BmNPV感染时间的增加，对照组病毒DNA增加显著，而灵菌红素处理组病毒DNA增加较缓慢，总量远低于对照组。其中，BmNPV感染48h、72h和96h后，灵菌红素处理组病毒 DNA总量仅分别为对照组病毒DNA总量的3.0%、1.3%和5.7%。研究结果表明，灵菌红素可显著地抑制BmNPV病毒基因组DNA的复制。⑶采用qRT-PCR技术检测灵菌红素对BmNPV基因转录表达的影响。结果显示，灵菌红素

5、对BmNPV极早期基因ie-1、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录均有强烈的抑制作用。BmNPV感染72 h后，对照组病毒 ie-1表达量约为灵菌红素处理组的55倍；灵菌红素处理组vp39的表达量只有对照组的1.1%；而灵菌红素处理组p10基因的表达量极低，几乎检测不出。⑷弱酸性条件下，BmNPV表达的GP64蛋白可介导感染细胞发生膜融合。试验分别用低pH（pH4.5）和细胞正常生长所需pH（pH6.2）培养基短暂孵育BmNPV感