家蚕核型多角体病毒ORF75基因的克隆及表达.pdf

1、根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物，以家蚕核型多角体病毒为材料，利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(BombyxmoriNucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段，将其克隆至pMD18-Tvector上，获得了该基因成熟蛋白阅读框序列。利用设计的酶切位点将目的基因从T载体上切下。目的片断和表达质粒pGEX-4T-2经BamHI/XhoI双酶切，连接得到重组表达质粒pGEX/

2、Bm75。将重组表达质粒pGEX/Bm75转化入大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析表明产生57kDa左右的特异蛋白质条带。为了进一步检测表达产物是不是含有与GST融合的蛋白，以MouseAnti-GST为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠为二抗，对表达产物进行Westernblotting分析，结果表明，pGEX/Bm75经IPTG诱导产生的57kDa蛋白条带与抗体发生了很强的交叉反应，表明融合蛋白得到了

3、表达。该融合蛋白含有一个GST，可以在对融合蛋白进行亲和层析的同时，结合相应的蛋白酶切割实现目的蛋白的纯化。 本实验并对家蚕核型多角体病毒ORF75基因核苷酸序列进行了生物信息学分析，BmNPVORF75基因位于70485bp和71264bp之间，编码一个259个氨基酸残基的多肽，预测分子量为30.8kDa,等电点为7.67，分子式为C1409H2157N351O390S19；蛋白在大肠杆菌内的半衰期大于10个小时；酸性氨基酸(

4、Asp+Glu)占10.5％，碱性氨基酸(Arg+Lys)占10.8％；蛋白的不稳定指数为42.67，是不稳定蛋白。对Prosite数据库扫描，查到4类9个蛋白修饰位点。通过Blast搜索氨基酸同源序列发现，Bm75同源蛋白存在于所有测序的鳞翅目杆状病毒，不存在于其他非鳞翅目昆虫杆状病毒中。这表明，Bm75同源蛋白可能是鳞翅目杆状病毒所特有的。从同源序列比对的结果来看，Bm75蛋白的氨基酸序列与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autogra