Rab5a在卵巢癌细胞增殖中的作用及机制研究.pdf

1、卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,死亡率一直高居妇科肿瘤之首。卵巢癌的发生发展是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程。经过多年的努力,人们虽然发现了一些癌基因、抑癌基因的异常与卵巢癌密切相关,但对其发病的分子机制还未完全明了,因此发现新的卵巢癌相关基因及其作用机制对于完善卵巢癌的早期诊断和治疗,以及改善患者的预后都具有十分重要的意义。
　　 本研究第一章证实了Rab5a在卵巢癌中高表达。本课题组前期研究表明Rabex5表达在卵巢

2、癌组织高于非癌变卵巢组织,而其下游效应因子Rab5a的表达在卵巢癌高转移细胞株(HO-8910PM)高于低转移细胞株(HO-8910),因此我们推测Rab5a可能与卵巢癌有关。随后我们从本院病理科获取20例卵巢囊肿、20例卵巢腺瘤和39例卵巢癌石蜡包埋组织标本,通过免疫组织化学分析Rab5a的表达水平,发现该蛋白在卵巢癌中表达显著高于卵巢囊肿和卵巢腺瘤,而且阳性细胞在囊肿和腺瘤组织中仅局限于上皮层,但在卵巢癌组织中,阳性细胞侵袭入间质,

3、呈散乱分布。所以Rab5a的检测可能用于卵巢癌与非癌的鉴别诊断。本研究同时查询了39例卵巢癌患者的病史资料,并根据他们的病理分级、临床分期和腹腔转移分别进行分组,比较各组之间Rab5a表达的差异,结果显示Rab5a的表达与卵巢癌的病理分级、临床分期和转移无关。
　　 由于Rab5a在表皮生长因子受体(EGFR)介导的信号传导中起着重要作用,因此我们推测Rab5a表达变化可能影响卵巢癌细胞的生长。本研究第二章通过PCR扩增Rab5

4、a完整序列,分别插入pEGFP-N1(GFP)和pcDNA3.1(+)两个真核表达载体,构建了GFP-Rab5a、pcDNA-Rab5a重组体,分别转染卵巢癌细胞株HO-8910,经过G418筛选和流式细胞仪分选,建立了外源性Rab5a稳定表达的细胞模型。通过Western Blot分析发现GFP-Rab5a转染细胞中融合蛋白的表达是内源性Rab5a的3～5倍,pcDNA-Rab5a转染细胞Rab5a的表达是对照细胞的4～6倍。同时本研

5、究还利用siRNA技术抑制HO-8910细胞中Rab5a的表达,结果与对照细胞比较,Rab5a siRNA处理细胞中靶蛋白的表达量减少了90％以上,成功地建立了Rab5a表达抑制的细胞模型。通过MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-diphenytetrazo-liumromide]分析、CFDASE(Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl este

6、r)示踪分析和细胞周期分析发现,Rab5a表达增加能够刺激卵巢癌细胞从G1进入S期,促进细胞的增殖。相反,Rab5a蛋白表达减少则抑制了卵巢癌细胞的生长。
　　 Rab5a在内体的形成、移动、黏附和融合中起重要作用,并通过这一过程影响EGFR的内吞和细胞内运输,从而调节EGFR的信号传导和代谢过程。Rab5a有许多下游效应因子,如:EEA1(早期内体自身抗原1)、PI3K(磷脂酰肌醇3磷酸)、Syntaxin-4、APPL1(A

7、daptor protein containing PH domain,PTB domain and Leucinezipper motif)等,其中APPL1直接把表皮生长因子(EGF)的细胞外刺激与核内转录相连接。因此我们推测在卵巢癌细胞中Rab5a可能与APPL1相互协作而调节EGFR的信号传导,并进一步影响细胞的生长。本研究第三章利用RNA干扰技术抑制了HO-8910细胞中APPL1的表达。结果显示当APPL1表达被抑制后,HO

8、-8910细胞增殖也被抑制,表现为G1期生长部分停滞。而继续抑制Rab5a的表达,HO-8910细胞的生长停滞没有进一步增加,说明Rab5a可能通过APPL1来调节细胞的生长。随后,本研究利用激光共聚焦扫描显微镜观察发现Rab5a与APPL1能够在HO-8910胞浆中相互结合。血清饥饿过夜后,二者聚焦明显减少,当EGF刺激5min后,聚焦开始增加,15min达到峰值,然后二者逐渐分离。进一步研究发现,APPL1能够进入细胞核与MTA2(

9、metastasis associatedfamilyl,member2)相互作用,后者为NuRD(nucleosome remodelingand deacetylating)的组成部分,直接参与调节细胞内DNA的复制和转录。
　　 总之,本研究结果显示Rab5a在卵巢癌中表达显著高于卵巢囊肿和卵巢腺瘤,而且阳性细胞在癌组织和非癌组织中分布明显不同,因此该蛋白可能用于卵巢癌与非癌的鉴别诊断。通过建立细胞模型,本研究发现Rab5