重组腺相关病毒-人凝血因子Ⅸ基因在人-鼠结肠上皮细胞中表达的研究.pdf

第一章rAAV- 2介岢的GFP基因托人，鼠结肠癌刍U胞中的转移和表达

第一章2型重组腺相关病毒介导的绿色荧光蛋白基因在人／

鼠结肠癌细胞中的转移和表达

基因治疗的成功很大程度上取决于其载体对靶细胞的转导效率。重组腺相关

病毒(recombi nant adeno。associ at ed vi rus，rAAV．2)具有安全性好、宿主范围广，转

导效率较高，长期稳定表达，可转导分裂细胞和非分裂细胞的特点．是理想的基

因治疗载体。目前实验研究中最常用的为AAV- 2。靶细胞的选择对基因治疗亦极

其重要，它关系到给药方式。我们设想以结肠上皮细胞为靶细胞则可实现灌肠途

径给药，具无创、吸收面积大、不受消化酶影响、患者依从性好、由门静脉直接

吸收入肝而达到有效的肝脏途径优点。来源于维多利亚水母的绿色荧光蛋白

(green fl uorescent protei n，GFP)基因是一种新的报告基因，由于其产生荧光不需任

何底物或辅助因子，较传统的标记基因如B一半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等有

明显的优越性⋯。本实验采用已制备和纯化的rAAV- 2／GFP对人／鼠结肠上皮细胞

进行体外基因转移，观察GFP基因是否能在人l 鼠结肠上皮细胞中得到有效表达，

探讨该rAAV- 2介导目的基因转导人／鼠结肠上皮细胞治疗遗传性疾病等的可行

　　1．1材料与方法

　　1．1．1材料

　　1．11．1细胞株

人结肠癌细胞株SW480，大鼠结肠癌细胞株C26购自湘雅医学院肿瘤研究

　　1．1．1．2病毒

rAAV- 2／GFP由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家

重点试验室吴小兵教授惠赠。

1．1．1．3主要试裁

细胞培养试剂：DMEM培养基，0．25％t rypsi n，FBS为美国GIBCO公司产品。

丁酸钠由病毒基因工程国家重点试验室吴小兵教授惠赠。

1．1．1．4主要仪器

1)超净工作台为苏净集团安泰公司产品；

2)LD4．2型低速离心机为北京医用离心厂产品；

筘～章rAAV- 2介导的GFP箍圆4‘人／鼠结肠癌纠胞中的转移和表达

胞。2～3天传代一次，弃去培养液，PBS液洗涤3次，加入0．25％胰蛋白酶150ui ／

孔，37。C作用5rai n左右，倒置显微镜卜观察到细胞间隙增大即中止消化，以1：3

比例传代。分别于转导后14hr、24hr、2天、7天计数200个细胞在荧光显微镜下

绿色荧光的百分率，即转染率。

1．1．3统计学处理

数据用均数4- 标准误(x蟠E)表示，组间比较用单因素方差分析，两组比较采

用r检验，实验数据在计算机上用SPSS 11．0统计软件进行统计学处理。P

　　1．2结果

1．2．1 rAAV- 2／GFP对培养细胞Sw480／C26的体外转导

14小时即可看到部分SW480／C26细胞发出的绿色荧光，2天可见大部分细胞

发出明亮的绿色荧光，小部分细胞末见荧光，7天后可见发出绿色荧光的细胞较

2天减少，且荧光亮度明显减弱，阴性对照组无荧光。相同时间段MOI：t ×

10sv．g／cel l 加丁酸钠组的荧光最强，O．5×105v．g／cel l 组最弱。计数200个细胞在

荧光显微镜下绿色荧光的百分率，阳性率(见表1一I)。SW480／C26细胞株(MOI：

1×105v．g，cel l )GFP2天、7天阳性率分别为(324- 2．21)％，(394- 5．69)％和(284- 3．52)

％，(324- 4- 21)％(见图1—2)。

Tabl e．1- 1 The t ransduct i on effi ci ency ofSW480／C26 cel l s wi t h rAAV[ GFP r x±SE)

辣一章rAAV- 2介旨的GFP丛Bl 在人，鼠结肠癌细腿中的转移和表达

　　1．3讨论

基因治疗的成功很大程度上取决于其载体对靶细胞的转导效率。

靶细胞的选择对基因治疗极其重要，它关系到给药方式。基因治疗体外试验

已经在多种细胞系及原始细胞中获得成功，如成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、内

皮细胞、角质细胞、造血干细胞等【2’”l 。肝脏在载体给予剂量上存在明显的优

势，可通过影像定位门静脉注射的方法使肝细胞作为靶细胞实现，肌肉途径的优

点在于给药方便，但两者均有创。我们设想以结肠上皮细胞为靶细胞则可实现灌

肠途径给药，具无创、吸收面积大、刁i 受消化酶影n向、患者依从性好、由门静脉

直接吸收入_| H=而达到有效的肝脏途径优点，尤其适合于注射高风险的疾病，例如：

血友病。本试验所用的SW480／C26细胞是良好的口服吸收的体外筛选模型。rAAV

载体对肠上皮转导具有不确定性。目前尚无相关报道。

大量的实验结果提示rAAV是基冈治疗的理想载体。腺相关病毒(AAV)是

一种单链的微小DNA病毒，属细小病毒科，需要辅助病毒才能有效地复制和感

染，它足迄今为止发现的病毒中，唯一与人类疾病无任何相关性的病毒，具有与

人类疾病无相关性、免疫原性弱、宿辛范围广及能长期表达外源基因的特点，并

能感染非分裂期的细胞，是较理想的基因治疗载体。本实验所采用的rAAV- 2去

除了复制蛋白Rep及包装蛋白Cap基因，仅具有感染宿主细胞的功能，安全性

较高。rAAV载体进入宿主体内后，山于没有对整合、复制起重要作用的Rep蛋

白的存在，所以一般认为无法进行定点整合。AAV- 2的转导效率主要受靶细胞种

属、细胞表面与相应的AAV受体的密度和数量、感染复数、细胞表面是否有足

够的辅助受体介导～^v的内吞、外源基因的表达和细胞周期的影响。一些包括

生物、化学、物理的方法亦用来提高rAAV的转染效率，如用表达AdE40rf6蛋白

的腺病毒与AAV共转染靶细胞，用羟摹腺(HU)[ 4l 】或用紫外线1421' X2射线对靶细

胞进行预处理均能有效提高rAAV的转染效率Qi ng等m1发现，rAAV对各种细

胞系和各种组织的转染效率均与这些细胞内ssD2BP的去磷酸化水平成正比，而

用上述方法预处理细胞，可使细胞内ssD2BP的去磷酸化与磷酸化的比值增加，从

而增加转染率并使转基因在人体细胞内得到长期而稳定的表达。进一步研究表明，

细胞内的人表皮生氏因子受体蛋白酪氨酸激酶对ssD2BP的磷酸化起促进作用，

用此酶的抑制剂能够使rAAV的转染效率增] j Ⅱr44l 。AAV- 2分子病毒学的研究显

示，AAV- 2对细胞的进入是受体介导的，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是AAV- 2

的主要受体，1型成纤维细胞生长因予受体(FGFRl )和n VB 5整合素是AAV- 2

的辅助受体145I，还有学者报道c．met 可能也是AAV- 2的一种辅助受体。有研究

证实，如果细胞表面仪表达主要受体，而无辅助受体表达，则不能导致AAV- 2的有

效感染1461。我们比较了rAAV2在体外培养SW480／C26细胞在不同的感染复数

第一章rAAV- 2介导的GFP捧㈨在人，鼠结肠擗细胞中的转移和表选

和不同时间的转染效率，结果显示出了卅i 『司的转染效率。较阴性对照组，

SW480／C26细胞在14小时，24小时，48小时，7天的转导效率均有增高，且差

异有显著性意义(P

SW480／C26细胞表面均具有上述两类受体，可介导rAAV- 2进入靶细胞体内表达

外源基冈。SW480／C26细胞在14小时均开始有转导，随时间延长，转导效率升

高，48小时达高峰，后转导率渐下降，观察至第7天降至最低，比较7天和2

天GFP表达率，发现SW480／C26细胞系在7天GFP表达率均低于2天的GFP

表达率，虽然无统计学意义(P>0．05)，但外源基因能否长期稳定表达，还需逊

一步实验验证。rAAV- 2对靶细胞的转导效率还受到感染复数(MOI)的影响。MOI

过低，病毒不能对细胞形成足够的有效碰撞，没有足够的病毒结合受体，自然会

降低转导率，而MOI过高，则有可能竞争结合受体，造成病毒不能有效地同时

与受体结合而影响转导效率，因此寻找～个合适的MOI有利于提高基因的转导

率。因为各个实验室生产纯化rAAV的技术不一，rAAV的感染特性也不尽相同，

所以每种rAAV的MOI也不一致。本研究采用rAAV- 2／GFP以不同的MOI( 0．5

X105 v．g／cel l 、1×105v．g／cel l 、2×105v．g／cel l )转导SW480／C26细胞，荧光显微

镜下观察发现相同的时问段MOIl ×105时发出绿色荧光的细胞最多，因此该

rAAV- 2感染SW480／C26细胞适宜的MOI为l ×105v．g／cel l 。超过1×105v．g／cel l ，

其转导基因的表达量反而有所降低，存在过量抑制现象。研究147- - 481表明，组蛋

白的去乙酰化作用与转基因的表达有明显的相关性．组蛋白的去乙酰化作用能抑

制基因的表达。丁酸钠主要是通过提高组蛋白乙酰化增强病毒转基因的表达。

AAv2介导的外源基因的表达对丁酸钠的刺激表现了相似的作用。在基因治疗研

究巾，当rAAV- 2携带的外源基因的表达晕较低的情况下，加丁酸钠刺激能增强

基因的表达，提高检测的灵敏度。本实验SW480／C26细胞MOIl X105v．g／cel l 加

丁酸钠组较单纯rAAV- 2(MOIl ×105v．g／cel l )在48hr的转导效率均有提高，差

异具统计学意义(P<0．05)，从而证明J1酸钠能增强rAAV- 2携带的外源基因的

上述实验结果说明在合适的转导条件下，该rAAV．2能有效地转导

SW480／C26细胞，提示浚rAAV一2可介导肠上皮细胞的基因治疗，可进一步研究

在人／鼠肠上皮SW480／C26细胞的长期表达，探索该rAAV一2能否用于血友病B

　　1．4结论

1．rAAV- 2／GFP能有效地转导SW480／C26细胞，感染复数为1×10’v．g／cel l 在同

2．丁酸钠能刺激增强转导效率，提高检测的灵敏度。

第二章rAAV- 2介导的hFIX基㈨在人，鼠结肠痛细胞中的转移和表达

第二章2型重组腺相关病毒介导的人凝血因子l X基因在

人／鼠结肠癌细胞中的转移和表达

基因治疗的关键在于载体和靶细胞。2型腺相关病毒(AAV- 2)n- I"满足基因治

疗对载体的基本要求。靶细胞的选择对hFIX的表达极其重要，它关系到给药方

式。体外FIX表达已经在几种细胞系及原始细胞中获得成功，如成纤维细胞、肌

细胞、肝细胞、内皮细胞、角质细胞、造血T细胞等。其中主要是成纤维细胞、

肝细胞及肌细胞。肝脏在载体给予剂量卜存在明显的优势，可通过影像定位门静

脉注射的方法使肝细胞作为靶细胞实现，肌肉途径的优点在于给药方便，但两者

均有创。如果以消化道上皮细胞作为FIX的靶细胞，则可实现无创。口服途径

的hFIX可能会被胃液降解，我们设想灌肠途径给药，则可实现无创、吸收面

积大、不受消化酶影响、小儿依从性好、由门静脉直接吸收入肝而达到有效的肝

脏途径结果。结合rAAV- 2载体与结肠上皮绌胞细胞两者的优势，我们设计以结

肠上皮细胞为靶细胞，观察rAAv- 2／hF IX在结肠上皮细胞的导和表达水平。rAAV

载体对肠匕皮转导具有不确定性，并上土在表达过程中hFIX要经过一系歹U翻译后

修饰，才具有生物活性，其中vi 傲依赖反应中蛋白N端12个谷氨酸残基的Y

羧基化为凝血活性所必需，人们对肠卜I皮是否有谷氨酸羧化酶，能否分泌具有生

物活性的hFIX还存在疑虑。本实验章节予rAAv_2，hF Ix感染人／鼠结肠上皮细

胞，PCR法检测rAAV- 2haFIX转导细胞中hFIX基因的表达，ELl SA试剂盒检测

FIXAg量，一期法检测hFIX活性。观测hFl X在结肠上皮细胞中的表达情况。

　　2．1材料与方法

　　2．1．1材料

2．1．1．1细胞株

入结肠癌细胞株SW480，大鼠结肠癌细胞株C26购自湘雅医学院肿瘤研究所

2．1．1．2病毒rAAV- 2／hFIX为由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒

基因工程国家重点试验室吴小兵教授惠赠。

2．1．1．3主要试剂

1) 细胞培养试剂：DMEM培养基，0．25％t rypsi n，FBS为美国GIBCO公司产

2) 凝血因予Ix含量测定( ELISA) 试剂盒为上海太阳生物技术公司产品；乏l x

血浆、正常标准皿浆、APTT促凝剂(高岭上)为美国Paci fi c Hemastasi s产品。

第一章rAAV- 2介导的hFIX耩闲确：人，鼠结肠癌细胞中的转移舄I表达

　　2。2结

2．1．1 sw480，C26细胞的hFIX基因的表达

2．2．1．】提取的DNA质量的鉴定

取4I．t l DNA琼脂糖电泳后，紫外灯下可见到DNA呈一条明亮的区带，没有

拖尾现缘，提示DNA末降解。取29l 溶解的DNA在紫外分光核酸蛋白分析仪

上测OD值，DNA的OD260／OD280为1．8～2．0，无蛋白质和RNA污染。

　　2．2．1．2

SW480／C26细胞hFIX基因的表达

PCR方法检测了SW480／C26细胞DNA的hFIX基因的表达，SW480未转导

组的14大、21天DNA仅扩增出一条阳性条带，大小为37l bp，而转导组的14

天和21天的DNA扩增后均可见到两条阳性条带，大小为371bp和183bp，分别

为内源的hFIX基冈片断和外源hFIX的插入片断( 图2—3) ；C26细胞未转导组

DNA未见到阳性条带，而转导组14天、21天的DNA均可扩增出一条清晰的阳

性条带，大小为183bp(图2—4)。SW480，C26细胞扩增了内参，扩增片断大小

　　400bp

　　300bp

　　200bp

　　100bp

PCR法检测SW480培养细胞DNA中hFIXcDNA的表达

l ，2：转导绡14天、21天；

3，4：未转导组14天、21夫：

5，6：第14天、21犬G3PDH内参对照

第一章rAAV- 2介导的hFIX基嘟直人，鼠结肠癌细胞中的转移车¨ 表达

一期法测SW480／C26细胞n：不1剐j 段分泌的hFIX的活性(o±距)

注j 转导绸与未转导组比，，<0，0】。

　　2．3讨论

血友病B是基劂治疗的首选疾病。首先它是一种单基因疾病，FIX的表达没

有严格的组织特异性，不需要精确地调控，少量的FIX即可改善患者的出血症

状，提高重型血友病人的生活质量，而大量的FIX，即使达到正常血浆水平的

150％也不会引起栓塞症状。而且FIX蛋白能够在不问的细胞类型中表达，并且很

容易分泌进入血液循环。目前已有较多成功的动物模型如基因剔除小鼠，血友病

人等，为血友病基因治疗的临床前研究提供了便利。目前临床治疗血友病B主

要为输fffL、补充凝血酶原复台物或补充hFIX浓缩制剂，给药途径为肌注或静脉

注射，但此两种方式均为有创性，给药同时亦有肌肉出血及局部血肿形成的风险，

如果以消化道上皮细胞作为FIX的靶细胞，则可实现无创。口服途径的l l FIX Iq

能会被胃液降解，我们设想灌肠途径给药，则可实现无创、吸收面积大、不受

消化酶影响、小儿依从性好、由门静脉直接吸收入肝而达到有效的肝脏途径结果。

我们设计以结肠上皮细胞为靶细胞，观察rAAV- 2／hF IX在结肠上皮细胞的导入

和表达水平。试验所用的SW480细胞是良好的口服吸收的体外筛选模型。SW480

细胞柬源于人体结肠腺癌细胞，能在培养过程中进行肠细胞分化，其单细胞层可

作研究小肠表皮细胞转运和代谢的体外模型，具有生长快，代谢周期短的优点。

SW480细胞在体外所得结果与人体口服吸收程度相关性良好。C26细胞则为进

一步的动物试验打下基础。实验第一部分已证实以GFP为示踪蛋白的rAAV能

有效转导结肠上皮细胞，但rAAV／hFIX对肠上皮转导仍具有不确定性。

体外FIX表达已经在几种细胞系及原始细胞中获得成功，如成纤维细胞、肌细

胞、肝细胞、内皮细胞、角质细胞、造血_r细胞等。其中主要是成纤维细胞、肝

细胞及肌细胞。rAAV／hFIX对肠上皮转导具有不确定性，人们对肠～k皮是否有谷

筘_审rAAV一2介导的hFIX毖Ⅲ莉．人／鼠结肠痈细胞中的转移和表达

人／鼠肠上皮细胞表达hFIX，为下一步的体内表达提供了可靠依据，但能否长期

稳定表达还需动物实验进一步证明。

　　2．4结论

rAAV- 2／hFIX能有效地转导人，鼠肠上皮SW480／C26细胞并表达具有凝血活性

的功能蛋白hFl X。

血友病B是一种遗传性疾病，基因治疗是理论上可治愈疾病的的方法。经

过各田学者十余年来的研究，已经取得初步成效，但仍存在(1)病毒载体安令

性(2)有创性的给药方式的问题，因此，本实验采用公认的安全性较高的rAAV- 2

作为载体，选择人／鼠肠上皮细胞为靶细胞，探讨hFIX在人／鼠肠上皮细胞中的

表达情况，结果表明：

1．rAAV- 2／GFP能有效地转导SW480／C26细胞，感染复数为1 X10’v．g／cel l

在同一时间效率最高。

2．丁酸钠能刺激增强转导效率，提高检测的灵敏度。

3．rAAV．2／hFIx能有效地转导人／鼠肠上皮Sw480／c26细胞并表达具有凝j ffL

活性的功能蛋白hFIX，并可持续2l 天。

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