蛋白酪氨酸磷酸酶1B在3T3-L1前脂肪细胞分化中的作用研究.pdf

1、一、3T3-L1前脂肪细胞的培养、鉴定及标志物检测背景和目的： 3T3-L1 前脂肪细胞株，目前最常用的前脂肪细胞株之一，是一种从Swiss 3T3小鼠19天的胚胎中分离克隆获得的具有脂肪细胞分化潜力的细胞株，在融合成单层的情况下具有自发分化为成熟脂肪细胞的能力。 本实验通过对3T3-L1 前脂肪细胞的形态、生长增殖、脂肪含量等细胞生物学特性的研究，诱导分化3T3-L1前脂肪细胞，摸索培养和诱导3T3-L1 前脂肪细胞的

2、最佳条件，为应用药物干预3T3-L1前脂肪细胞增殖分化以及后期研究3T3-L1 前脂肪细胞分化过程中基因表达等奠定基础。 方法： 1、3T3-L1前脂肪细胞的复苏、体外培养、计数以及细胞冻存； 2、3T3-L1 前脂肪细胞的诱导分化； 3、油红O染色法鉴定成熟脂肪细胞； 4、采用逆转录聚合酶链反应 (Reverse transcription-polymerase chain reaction．R

3、T-PCR)检测3T3-L1 前脂肪细胞的诱导分化过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisomal proliferation activated receptor-gamma，PPARγ2)基因表达变化。 结论： 本部分实验通过对3T3-L1 前脂肪细胞的形态、生长增殖、脂肪含量等细胞生物学特性的研究，摸索出了培养和诱导3T3-L1前脂肪细胞的最佳培养条件和诱导剂浓度，油红O染色以及脂肪细胞中。PPARγ2基

4、因表达的检测均显示3T3-L1脂肪细胞诱导分化成熟，为应用药物干预3T3-L1 前脂肪细胞增殖分化以及后期研究 3T3-L1 前脂肪细胞分化过程中基因表达等奠定基础。 二、3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化中PTP1B表达变化背景和目的： 作为最早被纯化的蛋白酪氨酸磷酸酶之一，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosinephosphatase 1B，PTP1B)一直被认为是胰岛素受体后信号转导的主要负性调控因子，

5、近年来更是成为治疗肥胖、2型糖尿病等胰岛素抵抗相关疾病的新靶点。 本研究首次采用3T3-L1前脂肪细胞系，通过体外培养诱导分化，观察脂肪细胞分化成熟过程中PTP1B表达变化，为进一步揭示PTP1B在脂肪细胞分化和脂质积聚过程中的作用提供线索。 方法： 1、3T3-L1细胞的培养和诱导分化； 2、油红O染色法鉴定成熟脂肪细胞； 3、采用逆转录聚合酶链反应技术 (Reverse transcripti

6、on-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测3T3-L1前脂肪细胞分化过程中PTP1B mRNA表达； 4、采用实时荧光定量聚合酶链反应 (Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-FQ PCR)半定量检测3T3-L1 前脂肪细胞分化过程中PTP1B mRNA表达； 5、采用western blot方法检测3T3-L1前脂肪细胞分化过程中PTP1

7、B蛋白水平表达。 结论： 本研究首次发现在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中，PTP1B mRNA及蛋白表达水平随着脂肪细胞分化成熟而逐步减低，至脂肪细胞完全成熟时达到最低点，提示PTP1B对于脂肪组织分化成熟的直接作用是抑制性的，PTP1B水平降低对于脂肪细胞分化成熟，脂质积聚则起到了“允许”甚至是“促进”作用。 三、肿瘤坏死因子-α及罗格列酮对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化过程中PTP1B表达的影响背景和

8、目的： 已经证实，除了调节机体能量代谢平衡外，脂肪组织，作为一个重要的内分泌器官，分泌多种激素和细胞因子如瘦素、抵抗素、脂联素、肿瘤坏死因子等，参与了机体更广泛、更复杂、更重要的内分泌代谢调控。越来越多的研究表明，脂肪细胞分化异常，而并非仅仅的脂肪组织过度生成，才是发生2型糖尿病、高血压、冠心病等代谢性疾病的罪魁祸首。与糖尿病、冠心病等密切相关的中央型肥胖很可能是由于脂肪组织分化异常，无法产生足够数量的正常成熟脂肪细胞存储过多的

9、能量，进而将生脂压力转嫁至肝脏、肌肉等器官，导致脂肪异位沉积，最终诱发一系列的代谢性疾患。 蛋白酪氨酸磷酸酶1B，由于其可使胰岛素受体(InsR)及胰岛素受体底物蛋白(IRSs)等的酪氨酸脱磷酸化，一直被认为是胰岛素信号传导的负性调控因子。然而，PTP1B在机体各组织中的作用存在着明显的组织特异性。在肌肉、肝脏组织中已证实PTP1B水平降低，可使胰岛素受体和胰岛素受体底物蛋白磷酸化明显增强，反映胰岛素敏感性的指标如胰岛素诱导的机

10、体葡萄糖处置力 (insulin stimulated whole-bodyglucose disposal，ISGD)显著提升。而对于脂肪组织而言，PTP1B的作用目前仍不清楚，这些作用与机体胰岛素敏感性之间的关系，更是不得而知。 为此，本研究采用体外培养3T3-L1前脂肪细胞，观察脂肪细胞诱导分化过程中PTP1B蛋白表达水平变化，再以罗格列酮和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)分别

11、干预脂肪细胞分化成熟过程并观察PTP1B蛋白表达情况，以期了解PTP1B在脂质合成和成脂过程的作用以及罗格列酮及肿瘤坏死因子-α分别影响脂肪细胞胰岛素敏感性的机制。 方法： 1、3T3-L1细胞的培养和诱导分化； 2、油红O染色法鉴定成熟脂肪细胞； 3、采用western blot方法检测不同诱导剂诱导分化三组3T3-L1前脂肪细胞分化过程中PTP1B蛋白水平表达。 4、采用免疫沉淀和wester