家蚕核型多角体杆状病毒BmNPV orf98基因的功能分析.pdf

1、杆状病毒(Baculovirus)是昆虫病毒类中的最大的类群之一，它编码的蛋白质种类有90到180种，基因组大小为80～180 kb之间。目前家蚕杆状病毒(BmNPV)大部分基因的功能都已被研究，但仍然有一些基因的功能至今未知。因此，本论文就家蚕核型多角体杆状病毒BmNPV orf98基因为研究对象，研究该基因对病毒基因组的复制、转录以及病毒包装和基因表达等方面的影响。家蚕核型多角体病毒BmNPV orf98基因不是杆状病毒的核心基因，

2、此基因的插入或删除对BmNPV传染性没有明显的影响，但在病毒的复制、转录和包装等方面的影响至今未见报道。为了研究BmNPV orf98基因功能，通过λRed重组系统进行定点敲除BmNPV orf98基因，构建缺失型重组病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系统异位补回BmNPV orf98基因，构建补回型重组病毒Bm98-re-Bacmid。将野生型病毒(WtBacmid)、缺失型病毒（Bm98-ko-Bacmid）和

3、补回型（Bm98-re-Bacmid）分别转染家蚕细胞BmN。病毒滴度检测结果显示Bm98-ko-Bacmid可形成侵染性的病毒粒子，但数量降低;透射电子显微镜结果表明Bm98-ko-Bacmid只产生游离的杆状病毒粒子，数量明显减少，而WtBacmid和Bm98-re-Bacmid产生大量成熟的具有囊膜结构的病毒粒子。荧光定量PCR结果显示BmNPV orf98基因缺失对BmNPV病毒复制没有影响，但早期基因lef3、晚期基因vp39

4、和极晚期基因p10的转录水平而显著降低(p＜0.05)。上述结果表明:BmNPVorf98基因对病毒的复制是非必需的，但该基因的缺失引起早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10转录水平明显下降(p＜0.05)。为了研究BmNPV orf98的基因表达，构建了BmNPV orf98的原核表达载体，表达融合蛋白并制备多克隆抗体进行Western印迹。结果表明:用该融合蛋白作为抗原进行Western印迹，条带单一且浓，说明抗体可用

5、。然后用该抗体和转染了补回型病毒的家蚕细胞进行Western结果显示:随着转染时间的延长，ORF98蛋白在家蚕(BmN)细胞中的表达量也随之增长。综合研究结果表明:BmNPV orf98基因为病毒复制非必需基因，但该基因的缺失能够抑制病毒增殖和包装，且导致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录显著下降(p＜0.05)。BmNPVorf98基因编码的蛋白在不同表达时相分析，随着时间的延长，该蛋白表达量也随

6、之增多。
　　在杆状病毒基因组上将目的基因敲除或者突变是研究未知功能病毒基因最有效的方法。在本文中，通过Red重组系统和Bac-to-Bac系统分别构建Bm98-ko-Bacmid和Bm98-re-Bacmid两种重组病毒，然后将wtBacmid、Bm98-ko-Bacmid和Bm98-re-Bacmid病毒DNA分别转染家蚕细胞(BmN)，收集不同时相的病毒上清并进行10-1～10-12的梯度稀释，五天后统计细胞发病孔数和未发病

7、孔数，按照相应的公式计算TCID50。实验结果表明随着转染时间的延长3种病毒的TCID50也随之增大，将收集的病毒上清进行二次感染，细胞仍然发病，说明缺失型病毒仍然能产生具有感染性的BV。但在同一时相，缺失型病毒的TCID50低于wtBacmid和Bm98-re-Bacmid病毒且缺失型病毒转染的家蚕细胞发病时间较其它两者晚，说明该基因的缺失推迟了病毒发病时间，抑制了病毒的增殖;而将该基因补回后病毒滴度恢复到野生型水平，说明这种缺陷能通

8、过基因补回得到恢复且BmNPV orf98不是BmNPV病毒粒子装配的必需基因。而后在透射显微镜下观察48 h时相三种病毒粒子的包装情况，结果显示缺失型病毒只产生游离的杆状病毒粒子，且数量明显减少，而野生型和补回型病毒产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子;为了进一步了解BmNPV orf98的作用机制，将三种病毒分别转染家蚕细胞，荧光定量分析结果显示野生型、缺失型和补回型3种病毒的复制水平保持一致，无显著性差异(p＞0.05)，但该基因的

9、缺失导致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录显著下降(p＜0.05);在转染48 h和72 h时相，wtBacmid和Bm98-re-Bacmid病毒的转录水平趋于一致且明显高于Bm98-ko-Bacmid的转录水平。为了研究BmNPV orf98的基因编码的蛋白在不同时相的表达，构建了BmNPV orf98的原核表达载体，表达融合蛋白并制备多克隆抗体进行Western印迹。结果表明:用该融合蛋白作为

10、抗原进行Western印迹，条带单一且浓，说明抗体可用。然后用该抗体和转染了补回型病毒的家蚕细胞进行Western印迹结果显示:随着转染时间的延长，BmNPV orf98蛋白在家蚕(BmN)细胞中的表达量也随之增长。综合研究结果表明:BmNPV orf98基因为病毒复制非必需基因，但该基因的缺失抑制了病毒的增殖和包装，且导致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录显著下降(p＜0.05)。同时，BmNPV