家蚕核型多角体病毒基因p24的功能研究.pdf

1、P24是一种重要的核衣壳相关蛋白，其基因p24在杆状病毒生活史中所发挥的作用以及在细胞中的功能少有人研究，本实验选取BmNPV为载体对该基因进行深入研究。本实验首先扩增出含有Bmp24基因同源臂的打靶片段，利用Red重组技术实现了打靶片段与目的基因之间的替换，进而成功构建了Bmp24缺失型病毒并命名为Bmp24-ko-Bacmid;然后构建重组转移载体pF astBacHTB-p24，利用Bac-to-Bac系统将该Bmp24定点补回到

2、缺失型Bacmid的多角体启动子下游，成功构建了Bmp24补回型Bacmid并命名为Bmp24-re-Bacmid。
　　为了研究Bmp24在细胞中的调控功能，实验将缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)、补回型病毒(Bmp24-re-Bacmid)以及野生型病毒(wtBacmid)等量转染到正常的家蚕卵巢细胞(BmN)当中。病毒滴度测定结果显示3种病毒的转染都能够引起细胞发病，即都可以产生有感染力的子代病毒。通过滴度值得比

3、较，发现Bmp24缺失型病毒的滴度值显著低于野生型和补回型病毒（P＜0.05）。为了进一步了解Bmp24对病毒颗粒包装的影响，收集感染48h后的细胞进行透射电镜分析，电镜结果显示Bmp24缺失型病毒感染的细胞中只有少量细长的杆状结构，但在野生型病毒感染的细胞当中出现大量包装成熟的病毒颗粒。透射电镜显示缺失Bmp24仍然可以包装子代病毒，但对包装为成熟的病毒粒子有显著影响，与滴度测定结果一致。
　　为了研究Bmp24的缺失对病毒基因

4、组复制的影响，实验选取了ODV的囊膜蛋白结构基因Bmgp41为代表基因，进行qPCR分析。实验结果显示随着3种病毒基因组转染时间的延长，Bmgp41的拷贝数均增加，但各时相Bmgp41的拷贝数无显著差异。为了研究Bmp24的缺失对病毒基因组转录水平的影响，实验选取了BmNPV中非常具有代表性的3个基因进行RT-qPCR，分别是病毒早期基因Bmlef-3、晚期基因Bmvp39和极晚期基因Bmp10。RT-qPCR实验结果显示，相对于野生型

5、病毒，Bmp24的缺失会显著降低子代病毒基因组中Bmlef-3、Bmvp39和Bmp10的转录水平（P＜0.05），但Bmp24的补回可以弥补这一现象。综上所述可知，Bmp24基因的缺失对子代病毒基因组的复制水平没有显著影响，即是病毒复制的非必需基因;缺失Bmp24基因的Bacmid仍然可以产生有感染力的BV粒子，说明Bmp24基因不是BV形成的必需基因;但Bmp24的缺失会降低子代病毒的感染力，说明Bmp24对BV的感染力有一定影响。

6、RT-qPCR结果说明Bmp24基因缺失会降低病毒基因组早期、晚期以及极晚期基因的转录水平，即Bmp24的缺失对病毒基因转录水平有一定影响。
　　为了进一步研究该基因的性质，本实验将目的基因Bmp24克隆到原核表达载体pET-28a(+)上，在大肠杆菌BL-21(star)中诱导表达带有6×His标签的融合蛋白，大小约为24.8KDa，与预期一致。通过Ni柱纯化获得BmP24并进行BCA定量，通过免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体。EL