家蚕核型多角体病毒编码miRNAs的功能分析.pdf

1、蚕业是我们国家重要的经济产业，家蚕又是鳞翅目昆虫进行遗传学和分子生物学研究的模式昆虫。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是蚕业生产中比较常见的病毒，家蚕感染后会导致非常高的致死率，给蚕业生产带来重大的经济损失，培育对核型多角体病毒具有抗性的家蚕品种可以减小损失，然而至今该病毒还是蚕业生产的一个痼疾。miRNAs是由长度大约22-23个核苷酸组成，属于内源性的非编码RNA，由70个碱基左右的miRNAs前体加工而成。miRNAs通过RNA诱

2、导的沉默复合体（RISC）作用于靶基因的mRNAs的3' UTR序列，越来越多的证据表明在病毒感染宿主过程中，miRNAs在病毒与宿主相互作用中起到了重要的调控作用。本文通过高通量测序从感染核型多角体病毒的家蚕血淋巴中发现了14条病毒编码的miRNAs，并用实验方法验证了其中的7条，并对其中2条做了的靶基因的预测和调控功能的研究。主要研究结果如下：
　　1.通过高通量测序对感染家蚕核型多角体病毒的家蚕血淋巴中的miRNAs进行分析

3、，发现了14条病毒编码的miRNAs，通过颈环PCR验证了其中的7条，并递交到了NCBI数据库中，对其中表达丰度最高的2条（BmNPV-miR-364和BmNPV-miR-415），做了进一步研究分析。通过线软件RNA22和RNA hybrid对BmNPV-miR-364、BmNPV-miR-415与家蚕和病毒基因的3' UTR进行分析，发现BmNPV-miR-364的靶基因6个，BmNPV-miR-415的靶基因9个。
　　2.

4、分别构建BmNPV-miR-364前体、BmNPV-miR-415前体和15个靶基因的重组表达载体。将miRNAs与对应靶基因的3' UTR共转染家蚕BmN细胞，通过双荧光素酶检测系统（DLR）分析发现得到BmNPV-miR-415特定靶向家蚕基因Prx5037、attA和病毒靶基因GTA，BmNPV-miR-364特定靶向病毒基因DNA polymerase。分别用miRNAmimic和miRNA inhibitor对内源性BmNPV

5、-miR-364与BmNPV-miR-415进行了功能获得性和功能缺失性分析，发现BmNPV-miR-364与BmNPV-miR-415都能抑制各自靶基因的表达。
　　3.将BmNPV-miR-415转染进家蚕BmN细胞，用双向电泳技术分析后发现，转染BmNPV-miR-415后的细胞比未转染的多一个蛋白差异点。对该蛋白差异点进行质谱分析发现该蛋白并不是之前通过生物信息学分析预测得到的靶基因中的一个，而是雷帕霉素的靶标基因2（TO

6、R2），推测BmNPV-miR-415的靶基因编码的蛋白可能是表达量过低或者被高丰度蛋白所掩盖。
　　4.对BmNPV-miR-415与TOR2基因的序列进行分析发现，BmNPV-miR-415并没有靶向TOR2基因。用TOR2基因的3' UTR与高通量测序得到的家蚕的miRNAs进行分析，发现对TOR2基因的3' UTR有特异性靶向；构建bmn-miR-5738与TOR2基因的3' UTR的表达载体，与BmNPV-miR-415

7、分别转染家蚕BmN细胞，通过双荧光素酶的检测发现，BmNPV-miR-415与bmn-miR-5738均能上调TOR2基因的表达；通过qPCR分析感染核型多角体病毒的家蚕血淋巴中bmn-miR-5738与TOR2的表达发现，感染前24 h bmn-miR-5738、TOR2与BmNPV-miR-415的表达趋势一致，24 h后BmNPV-miR-415的表达水平一直升高，而bmn-miR-5738与TOR2的表达下调；对五龄起蚕第1天的