纳豆激酶高产菌株的选育及液体发酵工艺优化研究.pdf

纳豆激酶(Nattokinase,NK)是由纳豆芽孢杆菌[Bacill us subtilis(natto．var)]分泌产生的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸碱性蛋白酶。NK的纤溶机制为：①直接作用于交联纤维蛋白，对纤维蛋白原不敏感，不易引起出血倾向；②能够激活体内t-PA，可以温和、持续的发挥纤溶作用；③NK可水解纤溶酶原激活剂的1型抑制剂(PAI-1)，使其失活，PAI-1的失活可直接使纤溶作用增强。与目前临床上常用的血栓治疗药物链激酶(SK)、尿激酶(u-PA)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等相比，纳豆激酶具有溶栓效果明显；不易引起出血，安全性能好；能抗胰酶水解，经消化道吸收，不被破坏等优点。因此，将纳豆激酶开发成新型口服溶栓药将具有广泛的市场前景。 本研究采用诱变育种的方法选育纳豆激酶高产菌株；以紫外、微波为单因素分别对出发菌株BN3撑6进行诱变，确定紫外诱变的最佳条件为40W紫外灯、30cm照射时间20s，此条件下致死率为98.4％、突变率0.7％，该条件下诱变得到正突变株YSBN8、YSBN362；微波诱变最佳条件为菌悬液浓度10<'4>个/mL，作用时间5秒，此时致死率为99.2％，突变率为2.5％，该条件下得到正突变株YSBN411、YSBN467、YSBN484，YSBN497。相同培养条件下测得上述六突变株的产酶活性分别为出发菌株的128％、130％、118.7％，184.7％，143.3％和124.1％，其中YSBN467的固体发酵产酶活性为2200IU/g，是出发菌株的1.84倍；对其连续传代五次考察产酶能力差异，结果证明其遗传性状稳定。同时，实验还研究了诱变菌株的筛选方法——牛奶．琼脂板法，该法在诱变选育纳豆菌时能够大大减少工作量，科学可行。 实验还对琼脂粉、纤维蛋白平板法、纤维蛋白平板法、琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性的特点进行了比较研究；确定采用琼脂粉-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性；该法具有溶圈明显、易于测量、机械强度好、操作简便、成本低等优点，适用于纳豆菌的选育及纳豆激酶发酵工艺优化中对纳豆激酶的测定，通过实验确定该法的具体操作为：①琼脂粉．纤维蛋白平板法Ⅰ：将自制纤维蛋白原溶液与1.2％琼脂粉溶液分别置于55℃水浴中恒温15min，等体积混合，迅速摇匀后倒平板，每板中倒入15mL；②琼脂粉．纤维蛋白平板法Ⅱ：将自制纤维蛋白原溶液与等体积1.2％琼脂粉溶液混合，共热至沸，倒板。测定酶活的条件：取酶液10μl点板，25℃，放置16h，测量溶圈的垂直直径并以直径积表示溶圈面积。实验确定该法的测定下限为55IU/mL，精确测定范围为326.6～2200(IU/mL)。本实验研究了突变菌株YSBN467的最适液体发酵产酶条件，单因素考察后设计正交试验，确定了该菌株的最适摇床发酵条件为：麦芽糖1％，大豆蛋白胨2％，CaCl<,2>、K<,2>HPO<,4>、KH<,2>PO<,4>各0.02％；接种量4％，温度为30℃，初始pH为6.5，培养基装液量为20mL(/100mL三角瓶)，接种量4％，摇床转速为120r/min。在最适摇床发酵条件下，YSBN467液体发酵产酶活性为1232IU/mL。