家蚕膜镁转运蛋白(BmMMgT)的表达、纯化和功能的初探.pdf

1、在生命活动中膜蛋白承担着不可替代的生物学功能，成为许多分子药物作用时的主要靶点，但由于其自身具有的一些特性，天然膜蛋白的分离和纯化成为目前最大的难题。目前融合标签技术已被广泛的应用于研究膜蛋白的晶体结构和生物功能之中。膜蛋白基因家族MMgT于2007年在非洲蟾蜍的卵母细胞中被首次鉴定，进一步研究发现该家族是转运镁离子的蛋白家族之一。但家蚕中是否存在MMgT膜蛋白尚未见相关报道。
　　 本研究从家蚕蚕蛹cDNA文库中，获得一条与M

2、g2+转运相关的膜蛋白基因，命名为BmMMgT，生物信息学分析表明该蛋白是一个单次跨膜蛋白。为了研究BmMMgT在家蚕中的功能，首先利用DNA重组技术将BmMMgT基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中，经IPTG诱导后融合蛋白得到了高效表达，表达产物经镍离子亲和层析柱和阴离子交换柱纯化得到纯度较高的融合蛋白，质谱鉴定的结果表明该蛋白为目的蛋白。接着用纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰兔制备多克隆抗体，经间接ELISA法测定其效价达

3、1∶25600以上。同时利用载体上的凝血酶酶切位点，纯化出了无标签的膜蛋白BmMMgT。为了解析膜蛋白BmMMgT的三维结构，本研究不仅对该膜蛋白的结晶条件进行了筛选，同时也对该膜蛋白与本实验室已经解结构的Mn-SOD融合表达的蛋白进行了结晶条件的初筛。进一步利用His-tagpulldown技术研究了膜蛋白BmMMgT与蚕蛹粉全蛋白相互作用的分析，质谱鉴定结果表明钓出的该蛋白可能是家蚕神经肽前体(orcokninprecursor)。