家蚕核型多角体病毒P10蛋白的原核表达、纯化与结晶条件筛选.pdf

1、杆状病毒P10蛋白属于极晚期表达蛋白，是病毒复制的非必需蛋白。在感染晚期可以观察到宿主细胞的细胞质和细胞核中均有纤维结构的存在，这些纤维结构的形成与P10蛋白有关。同时，P10蛋白可能还参与了多角体囊膜的形成，对多角体的稳定可能起到一定的作用。后来有免疫学研究者提出，P10蛋白在结构上与细胞的骨架元素有相似性，而且能够与这些元素发生相互作用。如果能够得到P10蛋白的三维空间结构，将能更好的研究P10蛋白的各种作用机制。
　　 本

2、文以大肠杆菌表达家蚕核型多角体病毒P10蛋白，探索原核表达的P10蛋白的理化性质和结晶条件。首先构建pET-32a-p10重组表达载体并在大肠杆菌中表达。在NaCl浓度超过100mM的溶液中，表达的His6-P10重组可溶性蛋白经4℃静置8-10h发生自然沉降，而在不含NaCl的溶液中又会恢复到溶解状态，经实验证明，这两种状态可逆。Western Blotting和质谱进一步鉴定，证明发生自然沉降的物质是重组蛋白His6-P10，通过调

3、节溶液中NaCl的浓度获得较纯的重组蛋白。对自然沉降的重组蛋白进行非变性凝胶电泳分析，发现重组蛋白以聚体的形式存在于溶液中。为了探索P10蛋白的存在状态，构建pGEX-6P-1-p10载体，利用prescission protease对重组蛋白进行酶切，得到P10蛋白。经非变性凝胶电泳分析发现P10蛋白也是以聚体的形式存在于溶液中。P10蛋白在被感染的宿主细胞中会形成纤维结构，而在原核表达状态下会以聚体的形式存在，说明P10蛋白分子之间

4、可能存在某种相互作用，使其具有这种特性。为了进一步推进家蚕核型多角体病毒P10蛋白的研究，首先要从P10蛋白的空间结构来解释该蛋白的上述特性，因此初步筛选了His6-P10重组蛋白和P10蛋白的结晶条件。
　　 多角体病毒形成的包涵体主要是由多角体蛋白和P10蛋白构成，并且形成了多面体结构。为了研究这两种蛋白在组装过程中的相互作用，对这两种蛋白进行融合表达、结晶和空间结构研究，构建pET-28a-polh-p10重组表达载体，利

5、用多角体蛋白不同pH条件下的溶解特性分离表达的重组蛋白，并以凝胶过滤层析纯化，将纯化产物进行结晶条件的初筛。
　　 由于本实验室得到的MnSOD蛋白易于结晶，因此希望能将P10蛋白与其融合表达，在MnSOD结晶堆积的同时，牵引P10蛋白一起结晶，进而解析P10的空间结构。因此，我们构建了pET-28a-MnSOD-p10，得到的重组蛋白经过40℃处理、镍离子金属螯合亲和层析纯化，并将纯化产物进行结晶条件的初筛。最后得到MnSOD