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文档简介
1、本研究从实验室的膜蛋白库中筛选出一个膜蛋白,通过分析预测这个蛋白有三个跨膜区,为一个未知功能的膜蛋白,将其命名为HW。生物信息学分析发现,HW基因cDNA全长1230bp,开放阅读框(ORF)大小为294 bp,编码97个氨基酸残基,预测分子量大小约为10.93kD。基于膜蛋白难表达的问题,本课题利用多角体融合表达分别在大肠杆菌和家蚕细胞中表达该膜蛋白基因。根据HW基因cDNA序列的ORF框设计一对特异引物,PCR扩增出目的基因,克隆到
2、本实验室构建的融合多角体基因的载体pBacPAK8-Ph获得重组载体pBacPAK8-Ph-HW,该载体可以将HW基因与多角体基因融合,两者之间插入TEV酶基因序列,便于HW膜蛋白与多角体蛋白的分离。双酶切pBaePAK8-Ph-HW载体获得Ph-HW片段,克隆到pET-28a(+)相同酶切位点获得重组原核表达载体pET-28aq(+)-Ph-HW,将构建的重组表达载体转化BL21(DE3)E.coli感受态细胞,经PCR、BamHⅠ/
3、NotⅠ酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。采用终浓度为1mM的IPTG、28℃条件下诱导重组蛋白表达,裂解菌体SDS-PAGE分析发现有大小约40kD的目的条带。利用亲和层析方法纯化融合蛋白后,TEV酶酶切得到膜蛋白HW。家蚕细胞表达该目的蛋白,根据Bac-to-Bac系统,将上述获得的HW与多角体融合基因Ph-HW片段插入到pFastBacTMHTB载体构建重组转移载体pFastBac-Ph-HW,将pFastBac-Ph-HW重组载
4、体转化E.coli DH10BacTM感受态细胞。重组pFastBae-Ph-HW载体与穿梭载体bacmid发生同源重组,获得重组bacmid杆粒。重组成功的bacmid转染家蚕细胞,收集重组杆状病毒继续感染家蚕细胞,三次感染细胞后的重组杆状病毒用来大量感染家蚕正常细胞,收集感染的细胞进行SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明多角体融合的家蚕HW基因在家蚕细胞中成功表达。家蚕细胞中HW基因的RNAi实验表明该基因对家蚕
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