融合多角体的家蚕膜蛋白BmCPH43的表达纯化及结晶研究.pdf

1、为了探讨膜蛋白的表达问题，本研究从本试验室家蚕膜蛋白库中选取了BmCPH43蛋白，预测该蛋白有两个跨膜区，N端有一个信号肽。由保藏菌株质粒扩增得到BmCPH43基因的ORF序列，该cDNA序列全长568bp，含有一个243bp的完整开放阅读框(ORF:204---428bp)，编码80个氨基酸残基，预测分子量为8.2kD，等电点为5.27。将BmCPH43基因片段前连接多角体片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a(+)相应的酶切位点

2、中，构建了融合有多角体基因的重组pET-32a(+)载体，在多角体与BmCPH43之间引入了TEV蛋白酶切位点序列。经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组质粒正确。将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，经IPTG低温诱导(28℃)表达后，裂解菌体作SDS-PAGE分析，与阴性对照相比在55kD(融合标签18kD)附近有一条特异性蛋白条带，与预测值相符。
　　 重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中，分别采用两种不同的

3、方法进行纯化。一种通过多角体蛋白在碱性条件下溶解的特性，通过调节pH值的方法反复洗涤，对重组蛋白进行纯化，经溶菌酶消化、离心和不同pH值的缓冲液洗涤即可得到纯度在70％以上的重组蛋白的粗提物；另一种是利用亲和层析的方法纯化重组蛋白，通过尿素溶解包涵体，溶解上清通过NI亲和柱纯化重组蛋白。将纯化后的重组蛋白进行AcTEV酶切消化，SDS-PAGE结果显示，相比阴性对照，酶切样品多出两个条带，其大小分别对应BmCPH43和融合有pET-32

4、a(+)载体标签的多角体蛋白的大小。
　　 通过调节pH值纯化重组蛋白，以悬滴法点结晶，置于16℃结晶室培养。通过对结晶条件的摸索，确定在蛋白含量lmg/ml容易形成结晶，获得了融合有多角体的膜蛋白的结晶。
　　 真核表达通过家蚕杆状病毒表达系统Bac-to-Bac系统进行表达，通过SDS-PAGE及Western Blotting分析证明，融合蛋白Ph-BmCPH43已成功表达。RNAi、MTT检测结果表明BmCPH4