江西省部分地区耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药机制研究.pdf

多重耐药现象严重，但对多粘菌素、头孢哌酮／舒巴坦等抗菌药物仍有较高敏感

性。江西省耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌主要耐药基因为bl a OXA一51和bl a

OXA一23。江西省耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药与bl a OXA- 23上游存在插入序

列IsAbal 有关，与金属酶、OXA一24、OXA一58基因无相关性。

关键词：鲍曼不动杆菌；耐药机制；碳青霉烯类；金属酶；碳青霉烯酶；基

因型；插入序列基因(IsAbal )；聚合酶链反应PCR

obj ect i ve：To

i nvesti gate

t he genot ype

characteri sti cs

and t he rel at i onshi p

i nsert i on

carbapenem—resi stant

aci net obact er baumanni i

from Ji angxi

expl ore t he resi st ant mechani sms of carbapenem- resi st ant aci net obact er baumanni i ．

Met hods：A t ot al of 140 non· · repeat cl i ni cal

i sol ates of carbapenem—- resi stant

aci net obact er baumanni i

1 carbapenem ant i bi ot i c—sensi t i ve

st rai ns used as

cont rol were cont i nuousl y col l ect ed duri ng January- - December 20 1 0 from4 fi rst—- cl ass

hospi t al s at grade

ni among 3 di fferent regi ons of Ji angxi provi nce．Agar di l uti on

met hod was

det ermi nat e

anti bi oti c suscepti bi l i ty．Metal

aci net obact er baumanni i

was det ect ed by 2- mercapt opropi oni c aci d i nhi bi t i on test．

IMP, VIM，OXA一23，OXA- 24，OXA一5 1，OXA- 58 and Isabal - bl a oxa一23 genes were

ampl i fi ed and anal yzed by PCRand sequenci ng，i n order to cl ear t he expressi on of

maj or carbapenemase genes of aci net obact er baumanni i and i ts rel at i onshi p wi t h

i nsert sequence Isabal i n Ji angxi provi nce．

Resul t ：140 non- - repeat strai ns of carbapenem· · resi st ant aci net obact er baumanni i

whi ch al l cont ri but ed t o hospi tal —acqui red i nfecti ons were recovered fromthe pat i ent s

of Intensi ve Care Uni t(62)，Respi ratory Medi ci ne(57)，BumUni t(16) and Seni or

offi ci al s

i npati ent

Ward(1)i n Ji angxi

provi nce．The

resi stance

aci net obact er baumanni i

t o 22 ki nds of anti bi oti cs was hi gh．It Was onl y rel ati vel y

sensi t i ve t o pol ymyxi n(1 00％)and cefoperazone—sul bactam(95％)respecti vel y．There

si gni fi cant

synergi sti c

2- mercapt opropi oni c

cefoyazi di ne．The met al enzymes( a

l actamase)were not det cat ed i n al l

The DNAof t he st rai ns were ampl i fi ed by PCRusi ng 7 pai rs of speci fi c pri mers．

Genet i c anal ysi s showed t hat al l st rai ns carryi ng OXA一23，OXA- 5 1，IMP, VIMand 6

of whi ch carryi ng OXA一58，not cont ai ni ng OXA一24．Unl i ke t he sensi ti ve strai ns，al l

i sol ates of carbapenem- · resi stant

aci net obact er baumanni i

express Isabal · · bl aoxa· -23

oxa一23- l i ke

posi ti ve

strai ns，8

oxa- 51一l i ke

posi t i ve

st rai ns，8

l sabal -· bl aoxa· · 23 posi ti ve st rai ns and 6 bl a oxa· · 58· -like posi t i ve st rai ns were randoml y

for DNA sequenci ng．The

1 00％( GQ86 1 439．1)，99％(EU255296．1)，1 00％( GQ849 1 92．1)and 85％(CP002522．1)

respecti vel y．

Concl usi on：Carbapenem—resi st ant

aci net obact er

baumanni i es

di stri buted i n Int ensi ve Care Uni t s and Respi rat ory Medi ci ne of hospi t al s i n Ji angxi

Provi nce，and t he mul t i - drug resi stance i s becomi ng a seri ous probl em．In thi s study,

we fi nd t hat carbapenem- resi st ant aci net obact er baumanni i es ar e onl y more sensi t i ve

pol ymyxi n，cefoperazone—sul bact am and

l evofl oxaci n

resi stant

anti bacteri al

drugs．The anti bi oti c

resi stance may be caused by expressi on of

resi stance genes such as bl a OXA- 5 1，bl a OXA一23 and Insert sequence IsAbal exi sts

upst reamof bl a OXA- 23，however, t he met al enzyme，OXA- 24 and OXA一5 8 genes

are not rel evant．

Keywords：Aci net obact er

baumanni i ；Mechani sms

resi stance；

Carbapenem；

Carbapenemase；

Genot ype；

gene(IsAbal )；Pol ymerase chai nreact i on

第1章前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．

第2章材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．

2．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．

2．1．1菌株及来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯

2．1．3主要仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2．2．1细菌的鉴定及药敏试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2．2．2金属酶筛选试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2．2．3特异引物扩增耐药基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5

2．：；PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6

2．3．1反应体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯6

2．3．2反应引物及反应条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6

2．3．3扩增引物序列⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7

2．3．4电泳、结果观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7

2．3．5胶回收试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7

2．4 PCR产物测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8

第3章结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9

3．1 140株CRAB的病室来源分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9

3．2体外药物敏感试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9

3．3金属酶筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10

3．4碳青霉烯酶基因的检侧⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l

3．5基因扩增片段序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14

第4章讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17

第5章结论与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22

5．1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22

5．2展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22

致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23

参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．24

综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27

附j 畏⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40

Aci net obact er baumanni i

Carbapenem- resi st ant

aci net obact er baumanni i

pol ymerase chai nreact i on

Metal l o．beta．1actamases

cefot axi me

ceft azi di me

azt reonam

Cefoperazone sul bact am

ami kaci n

Ampi ci l l i n sul bact am

ci profl oxaci n

Levofl oxaci n

gent ami ci n

Pol ymyxi n

cephazol i n

moxi fl oxaci n

Pi peraci l l i n t azobact am

Amoxi ci l l i n cl avul ani c aci d

Sul fonami des

Pi peraci l l i n

Chl orampheni col

Ampi ci l l i n

Tet racycl i ne

InseIrt l onsequence

Oxaei l l i nase

Ext ended spect rump- l aetamas

Deoxyri bonucl ei c aci d

Et hyl enedi ami net e tetraeeti eaei d

Sodi umdodeeyl

sul phat e

Phosphat e buffered sal i ne

nat i onal nosocomi al i nfect i ons Survei l l ance

鲍曼不动杆菌(Aci netobacter baumanni i ，Ab)是目前最常见的不动杆菌，是一

种非发酵糖的革兰阴性杆菌，广泛分布于自然界、人体皮肤、口腔黏膜、呼吸

道和泌尿生殖道等，能够在潮湿和干燥表面存活，为条件致病菌，是引起引起

医院感染，尤其是呼吸道感染的重要致病菌。美国院内感染监测数据(nati onal

nosocomi al i nfecti ons Survei l l ance，NNIS)和中国院内感染病源菌耐药监测资料显

示，鲍曼不动杆菌是院内感染中仅次于铜绿假单胞菌的另一个重要的非发酵菌

碳青霉烯类对鲍曼不动杆菌有较强的抗菌活性，对革兰阴性杆菌产生的超

广谱B．内酰胺酶和AmpC酶稳定。但随着临床中亚胺培南、美罗培南等抗菌药

物的广泛使用，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性逐渐下降。自1991

年首例耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌( carbapenem resi st ant

Aci net obact er

baumanni i ，CRAB)在美国报道以来，CRAB陆续在世界各地爆发和流行【3J。美

国疾控中心称美国的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药率从1995年的9％迅速蹿

升到2004年的40％【31。一旦鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物出现耐药，几

乎对其他抗菌药物均耐药，患者有可能会面对无药可治的情况，这给临床抗感

染治疗提出了不容忽视的难题。因此，了解江西省耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌

的耐药机制，对防止其蔓延，指导临床的合理用药有重要的意义。

鲍曼不动杆菌耐药机制较复杂，主要涉及以下4个方面f4’5山、7】：1．产生碳

青霉烯酶，主要是Ambl er分类中的B类酶和D类酶，能对13一内酰胺类抗生素

有广泛的水解作用：2．改变抗生素作用靶位，主要是改变青霉素结合蛋白PBPs

和CarO蛋白，从而逃避碳青霉烯类抗生素的抗菌作用。3．膜蛋白的改变或缺失，

可使碳青霉烯类抗生素在Ab中扩散受阻；4．外排泵的过度表达，限制药物在细

目前已有大量研究表明，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌主要耐药机制是细菌

质粒或染色体编码的碳青酶烯酶。碳青霉烯酶是指能够明显水解至少亚胺培南

或美罗培南的一类B．内酰胺酶，Ambl er分子分类为A、B、D三类酶pJ。A类酶

为丝氨酸酶，见于～些肠杆菌科；B类为金属酶，因其活性位点有锌离子故得名。

这类酶能被金属鳌合剂依地酸(EDTA)抑制，能水解除了氨曲南之外的所有B．内

酰胺类抗生素，对亚胺培南的水解活性大于美罗培南。目前已发现的B类碳青

霉烯酶金属酶有IMP类、VIM类、SIM类。检测金属酶对于临床治疗方案的选

择至关重要。D类酶，即苯唑西林酶(OXA)，同样为丝氨酸酶，仅见于不动杆菌，

属于Bush分类中的第2d组，可被舒巴坦抑制【8J。OXA基因型分为4组【9J，以

OXA．23命名为第1组，包括OXA．27和OXA．49；2000年西班牙报道了检测出

OXA．24为首的第2组，包括OXA．25，26，40，72；2004年阿根廷Brown发现

OXA．51型碳青霉烯酶作为鲍曼不动杆菌中的一新型组；2005年由法国Laurent

Poi rel 研究报道而只有OXA．58型酶的最新组。有研究证明插入序列IsAbal 与

碳青霉烯类抗生素的耐药有关11 0。。我国报道最主要碳青霉烯酶表达的基因型是

OXA．23。所以研究IsAbal 插入序列与OXA．23的关系对研究江西省省耐碳青霉

烯类鲍曼不动杆菌的耐药机制有重要意义。

本研究通过收集140株江西省4家医院临床分离的非重复的耐碳青霉烯类

鲍曼不动杆菌菌株，用美国NCCLS推荐的琼脂稀释扩散纸片法进行22种抗菌

药物的耐药性测定，2．巯基丙酸抑制试验检测金属酶，PCR法测金属酶、OXA

酶的表达情况，来初步了解和探讨四家医院CRAB的耐药机制，为临床合理应

用抗菌药物，有效控制感染提供参考。

　　2．1材料

2．1．1菌株及来源

连续收集2009年12月一2010年12月南昌大学第一附属医院、江西

医院、新余市人民医院、九江市人民医院四家医院住院病人送检的CRAB标

株(剔除重复株)，标本种类分布：痰液115份、血液5份、分泌物14

液3份、其他3份。选l 株对碳青霉烯类、多粘菌素、头孢哌酮／舒巴坦

其他抗生素均耐药的鲍曼不动杆菌菌株作为对照株，此菌株来自于九江

医院。菌株全部用Wal KAway一40细菌鉴定仪鉴定。大肠埃希菌ATCC259

绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株。

　　2．1．2主要试剂

羊脂血平板、L—B肉汤培

细菌基因组DNA提取试

　　2．巯基丙酸

JETQUICKGel Ext ract i on

2掌EsyTaqPCRSuperMi x

Trans2KDNAMarker

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　　2．2方法

2．2．1细菌的鉴定及药敏试验

2．2．1．1鉴定：收集的鲍曼不动杆菌菌株接种于琼脂平板，35。C培养过夜

后挑取纯菌落，置于细菌鉴定条上，用美国BIO公司的全自动生化鉴定仪35。

培养3—13h再次鉴定判读，质控株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌

ATCC27853。

2．2．1．2药敏实验：采用琼脂稀释纸片扩散法(K—B)测各种抗菌药物的最

低抑菌浓度(Mi ni mumi nhi bi t i on concentrati on，MIC)。结果判定为敏感、耐

药、中介。判定标准参照2007年临床实验室标准化研究所(C1i ni cal

Laborat ory St andards Insti tute，CLSI)的临界值n¨ 。

2．2．1．3纯菌落接种至菌种保存管，置于- 80。C超低温冰箱保存。

2．2．2金属酶筛选试验

2．2．2．1细菌的复苏：取菌种保存管置于常温下解冻半小时，用无菌小镊从

保存管中夹出一颗小圆珠，均匀涂布整个血平皿。放入37。温箱培养24H。

2．2．2．2观察24H培养后结果，从血平皿上挑一菌种环的纯菌落制备菌悬

液，用涂满菌悬液的无菌拭子均匀涂布一新的血平皿。

2．2．2．3将l 张头孢他啶纸片(CAZ)置于刚涂好的血平皿上，距CAZ直径

约3cm处贴上一空白纸片。在空白纸片上滴入2ul

2一巯基丙酸，37。C温箱培

养24H后观察结果，若靠近2一巯基丙酸一测的CAZ抑菌环有扩大，此株为产金

2．2．3特异引物扩增耐药基因

2．2．3．1复苏细菌，制备菌液：(步骤同上)，24H培养后挑取一接种环的纯

菌落悬浮于2ml 的0．9％Nacl 中。

2．2．3．2 DNA提取

2．2．3．2．1取O．5毫培养菌液，10000rpm，离心30秒，弃上清，收集菌体。

2．2．3．2．2加入200 u 1缓冲液RB重悬洗涤细胞，10000rpm，离一5, 30秒，弃

2．2．3．2．3加入200 Il l 结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇充分混匀，再加入

20 u l 蛋白酶K(20mg／m1)溶液，充分混匀，70。C放置10分钟，冷却后加入100 u l

异丙醇，摇晃充分混匀。

2．2．3．2．4将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，10000 rpm，离

- C, 30秒，弃废液。

2．2．3．2．5加入500 u 1抑制物去除液IR，12000 rpm，离一L, 30秒，弃废液。

JJn入700 u 1漂洗液WB，12000 rpm离一L, 30秒，弃掉废液。加入500 u l 漂洗液wB，