家蚕质多角体病毒RDRP的基因克隆、表达及定位研究.pdf

1、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP)是RNA病毒增殖复制的重要酶类,具有转录酶和聚合酶的双重活性,即一方面参与mRNA的转录,指导合成病毒增殖复制所需要的蛋白质和酶类;另一方面参与以病毒RNA为模版的子代病毒基因的复制.家蚕质多角体病毒(Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,BmCPV)是呼肠孤病毒科,质多角体病毒属的代表种,为双链

2、RNA病毒.已有的BmCPV冷冻电镜三维重构的研究结果表明,在病毒衣壳五重轴的内表面各有一花形结构,位于B-突起(B-spike)的近内侧,推测为转录酶复合物(TEC),可能是BmCPV结构蛋白VP2的对应成分.应用RT-PCR和分子克隆等技术成功地从BmCPV中国株的dsRNA中分三段克隆了RDRP基因,大小分别为1442bp,827bp,1675bp,进行基因全序列的拼接后,获得了全长完整的BmCPV(C)RDRP基因(GenBan

3、k序列号为:AY496445),该基因全长3691bp,GC含量为41.99﹪,读码框为1-3678bp,共编码1225个氨基酸(GenBank序列号为:AAR88092).应用Vector NT和DNAtools等软件对其氨基酸序列一级结构进行预测和分析.对BmCPV-RDRP基因序列和pET-28b载体的限制性内切酶位点进行分析,设计合成三对表达引物,应用RT-PCR等技术利用pET-28b载体,成功构建了表达质粒pET28b-RD

4、RP,并用IPTG(1mmol/L)诱导的方法,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了带有6×His的融合蛋白,蛋白质分子量为138kDa.应用分子生物学方法和免疫电镜技术,通过对BmCPV(C)RDRP的基因克隆、表达及定位研究,使对BmCPV冷冻电镜三维重构方面的研究成果与分子生物学方面的研究结果有机地结合,从而为寻找RDRP的活性中心,研究病毒在体内的复制机制、酶的功能和活性等方面提供理论基础,也可以根据RDRP的活性中心结构开展短