家蚕膜蛋白BmOcular alb的表达与纯化研究.pdf

1、Ocular alb超家族蛋白属于G蛋白偶联受体(GPCR)类似蛋白,是一类可以与异三聚体G蛋白结合的膜蛋白,但与典型的GPCR不同的是Ocular alb超家族蛋白一般不存在于细胞膜而是存在于胞内细胞器(主要是黑色素小体和溶酶体)质膜,该家族在人体及小鼠体内与眼白化病的产生相关,但在其他物种内的具体作用机制不详。
　　 本研究从家蚕cDNA文库中,选取一个编码具有Ocular alb超家族蛋白保守序列的基因,命名为BmOcul

2、ar_alb(BmOA)。该基因在GenBank登录号为：DY230641。BmOcular alb蛋白由453 bp核苷酸序列编码的150个氨基酸残基组成,经生物信息学分析,该蛋白含有两个跨膜区,分子量为17.7 kD,等电点为9.94。将BmOA基因克隆到pBacPAK8-Ph-tev(Ph为多角体基因,编码29 kD大小的蛋白,tev为TEV酶切位点编码基因)质粒中,获得重组质粒pBacPAK8-Ph-tev-BmOA,经BamH

3、Ⅰ和NotⅠ双酶切后,将Ph-tev-BmOA插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒,并转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)。转化工程菌后以IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析及Western blotting检测,确定了融合蛋白Ph-tev-BmOA的表达。由于含有多角体的融合蛋白与天然多角体具有相同的特性,利用多角体的特性纯化该融合蛋白,通过简单的纯化方法(反复调节pH值)达到纯化融合蛋白的目的。同时,成功的构建了重

4、组pFastBacHTB-Ph-tev-BmOA质粒,通过Bac-to-Bac系统,成功构建了重组杆状病毒Bacmid-Ph-tev-BmOA;重组杆状病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞,获得了表达多角体融合蛋白的发病细胞,并在发病细胞中发现融合蛋白表达。为了分析BmOA基因的功能,进一步研究BmOA蛋白在家蚕中的作用,我们进行了荧光定量PCR,发现该基因在家蚕五龄幼虫的气门中的转录量最高。我们通过RNAi实验初步探索了,Bm