家蚕核型多角体病毒FGF的细胞和组织定位研究.pdf

1、成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowthFactors，FGFs)大都发现于脊椎动物(包括人)，是一种具有广泛生物活性的蛋白分子。已有研究表明，FGFs对机体发育、组织的结构与功能的维持、损伤的愈合与修复都有作用，还与肿瘤的发生和转移等多种病理过程有关。本研究分离纯化了柞蚕多角体病毒(Antheraeapernyinuclearpolyhedrinvirus，ApNPV)，并在对该病毒DNA序列分析时，发现了一个与人源fgf

2、基因相似的基因。该基因存在于所有已公布的杆状病毒全序列中，但功能未知。为了解该基因在病毒感染中所起的作用，本文在家蚕—杆状病毒的模型中对fgf基因进行了初步研究，包括对家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrinvirus，BmNPV)的fgf基因进行了克隆、表达和功能的研究，主要结论如下： 1.克隆了柞蚕多角体病毒ApNPV中的fgf基因。该基因大小为558bp，其读码框含有185aa，是一个新

3、基因。该基因已在GenBank上登录(登录号为AY641527)。 2.克隆和表达了家蚕核型多角体病毒中fgf基因。构建了原核表达载体pET28a-fgf,通过IPTG诱导表达后，SDS-PAGE显示在27kDa左右有一特异条带，与预测的蛋白质分子量大小一致。该蛋白在大肠杆菌中含量较高并以包涵体的形式存在，表达产物含有6个组氨酸残基，用Ni-NTA亲和层析柱高效纯化了表达产物。 3.以绿色荧光蛋白(greenfluo

4、rescenceprotein，GFP)作为融合基因，构建真核表达载体pCDNA3.1-gfp-fgf。该基因在高等哺乳动物细胞COS-7细胞中表达，并定位在细胞核内，可能影响COS-7细胞中DNA复制或基因的转录。 4.杆状病毒表达系统中，FGF在不同细胞系中表达定位不尽相同。构建重组转座载体Bacmid-gfp-fgfDNA，转染细胞获得重组病毒Ac-gfp-fgf,分别感染TN5和Sf9细胞使FGF在这两种细胞中过量表达

5、，发现该蛋白定位于细胞膜。构建重组转移载体pBacPAK8-gfp-frf与线性化的Bm-pBacPAK6DNA共转染BmN细胞，该蛋白定位于BmN细胞的细胞核中。FGF在不同细胞中定位不同，表明FGF分子与细胞间存在识别关系，即来源于亲和病毒的FGF才能被该细胞识别，作用于核内。 5.FGF在蚕体各个器官中的表达具有一定的靶向作用。Bm-GFP-FGF重组病毒注射四龄蚕，以Bm-GFP病毒作为对照，对蚕感染后不同时期的主要器