蝎毒增殖肽的分离、纯化、鉴定以及促增殖作用和机制的初步探讨.pdf

第一部分 蝎毒促增殖肽的分离及纯化

（一）实验动物：C57BL/6 小鼠，雄性，购自广东省实验动物中心（具备实

（二）细胞株:小鼠源性粒白血病细胞株 M-NFS-60 细胞，为 rh-MCSF 依赖

的细胞株，其生长也可依赖 IL-3，购自美国 ATCC 公司（CRT-1838TM）

葡聚糖凝胶 Sephadex G-50

琼脂糖凝胶 CM-Sepharose FF

郑州天美科贸有限公司

DMEM 细胞培养基

RPMI1640 细胞培养基

IMDM 细胞培养基

Recombinant Human M-CSF

Peprotech 公司

Recombinant Human IL-3

Peprotech 公司

第二部分 蝎毒促增殖肽的机制研究

（一） 细胞株:M-NFS-60 细胞，为 rh-MCSF 依赖的细胞株，购自美国 ATCC 公

司（CRT-1838TM）

RPMI1640 细胞培养基

Recombinant Human M-CSF

Peprotech 公司

Recombinant Human IL-3

Peprotech 公司

IL-3Rα Antibody

Santa Cruz公司

FITC 标记羊抗鼠 IgG

ProteinTech Group公司

Cell Signling Technology公司

Bio-Rad DC 蛋白定量试剂盒

Bio-Rad公司

Phospho-Jak2 Antibody

Cell Signling Technology公司

Jak2 Antibody

Cell Signling Technology公司

Phospho-Stat5 Antibody

Cell Signling Technology公司

Stat5 Antibody

Cell Signling Technology公司

Santa Cruz公司

羊抗兔 IgG HRP 抗体

Santa Cruz公司

羊抗鼠 IgG HRP 抗体

Santa Cruz公司

预染蛋白 Marker P7708V

New England Biolabs

丙烯酰胺（Acr）

近几十年，关于蝎毒多肽分离提纯和生物学作用的研究越来越多，已分离提

纯的有抗肿瘤肽，抗癫痫肽，镇痛肽，离子通道阻滞剂等等[7-11]，而分离提纯的

方法多种多样。周新华[18]最早应用 CM-Sephadex C-50 离子交换层析技术将辽宁

东亚钳蝎蝎毒分离得到 12 个组分，分子量在 8 000～9 000。随后吉永华等[19]应

用 CM- SephadexC- 50 柱层析分离,共分出 13 个峰, 分子量在 7 000～9 000。

1994 年吉永华等 [20]又首次直接应用 RP-HPLC 对蝎毒进行了分离，并且应用两

种不同的 HPLC 系统反复分离，最终得到了 4 个软瘫型昆虫毒素。董伟华、孔天

翰等[21-23]分别应用 Sepharose FF 凝胶柱、 凝胶层析及 HPLC 等方法分离蝎毒,

成功地分离出一种抗肿瘤活性成分, 其分子量在 6 000～7 000, 与国外所报道的

其它蝎毒素的分子量情况类似。随着分子生物学的发展，用基因克隆表达的得到

多种类蝎毒组分。每种分离提纯的方法都有其优缺点，RT-HPLC 的方法流程时

间短，但是每次上样量较少，产率较低，分离出的组分生物活性会受到一定影响；

而柱层析的方法一次上样量较大，产量大，对生物学活性影响较小，本课题就选

用了两步柱层析的方法从蝎毒中分离提纯新组分。从本实验分离提纯的结果可以

看出，通过第一步 Sephadex G-50，第二步 CM-Sepharose FF，成功分离出两种纯

度较高的蝎毒组分 B4，B5，其中 B5 纯度最高，且验证了生物学活性，有促进

小鼠骨髓细胞增殖的效应，申报了发明专利。

骨髓造血组织，特别是骨髓幼稚细胞对辐射非常敏感。骨髓辐射损伤后导致

的造血功能的衰竭是辐射致死的主要原因之一。辐射防护剂是用于避免或者降低

放疗对正常细胞组织副作用的一类药物，目前备受关注的也最有效的药物是氨磷

汀(WR - 2721)，氨磷汀已被 FDA 批准为辐射保护剂[24]，但是副作用明显恶心、

呕吐、 高血压、 体重减轻、 吞咽困难等，限制了临床应用；所以找到低毒、

高效的辐射防护剂尤为重要。新型抗放药的一个途径是刺激、维持、增殖骨髓造

血祖细胞。细胞因子能刺激造血干细胞，干细胞因子( SCF)和血小板生成素( TPO)

的联合治疗能协调保护 CD34+CFU-megakaryocytes 免于 X-射线导致的死亡[25]。

细胞因子要发挥作用很重要的因素是干细胞的数量不能全部死亡，造血恢复依赖

1. 首次从蝎毒中分离纯化了蝎毒增殖肽 BmKpp，并申请了发明专利，专利公布

号：ZL201010508153.9，为以后的研究奠定了基础，也为开发蝎毒新功效

2. 初步证明 BmKpp 具有促骨髓细胞增殖的作用，并可能通过上调 IL-3R 的表

达和增强 Jak2 和 Stat5 信号蛋白的磷酸化发挥其促增殖作用。

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