家蚕膜蛋白PRMC2的分离纯化与结晶初探.pdf

1、膜蛋白是一类结构独特功能强大的蛋白质，执行多种基本而又重要的细胞生物学功能，如:物质的运输，膜内外信号的传递及能量转换等，是多种药物的作用靶点。但是，膜蛋白含量低、疏水性强、水溶性不好，且大部分存在糖化、乙酰化、甲基化等翻译后修饰，造成膜蛋白在结构上的特异性，对当前的蛋白质组学技术提出了巨大的挑战。因此，如何分离纯化和鉴定生物膜上的膜蛋白，特别是膜内在蛋白，是生物膜蛋白组学现阶段研究的重点和难点。
　　 家蚕杆状病毒在细胞的感染

2、晚期以出芽病毒的方式穿过宿主细胞膜，被病毒穿膜后的宿主破碎细胞膜融合后形成细胞膜囊泡。本文以家蚕杆状病毒感染晚期的蚕蛹为材料，经过匀浆、低速离心、超速离心、密度梯度离心等一系列技术手段，获得较纯的细胞膜囊泡，然后采用含有两性离子去垢剂(CHAPS)的膜蛋白提取液从细胞膜囊泡中提取膜蛋白。利用自制的PRMC2抗体亲和层析柱初步对目的蛋白进行分离纯化，再利用AKTAexplorer10蛋白纯化系统的离子交换层析和凝胶过滤层析进一步分离纯化，

3、获得的蛋白样品最后经过双向电泳进一步分离后，通过MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定为家蚕膜蛋白孕酮受体膜组件2(Progesteronereceptormembranecomponent2简称PRMC2)。
　　 为了探索PRMC2的蛋白三维结构，我们采用悬滴法结晶来进行研究，由于天然膜蛋白丰度很低，不利于大量富集进行结晶研究，因此，我们通过构建两种重组原核表达质粒pET-28a-PRMC2和pET-28a-MnSOD-PRM

4、C2，并在大肠杆菌中表达，通过镍柱和阴离子交换层析分离纯化该目的蛋白，将纯化后的目的蛋白进行结晶条件探索，并得到PRMC2蛋白的针状簇形不规则蛋白质晶体。
　　 为了对该蛋白结晶进一步探索和优化，我们将该蛋白疏水区的跨膜域和亲水区的功能域进行分段表达，分别构建pET-28a-PRMC2TM（TM为跨膜域的简写）和pET-28a-PRMC2FT（FT为功能域的简写），并在大肠杆菌中表达，通过镍柱和阴离子交换层析分离纯化这两种目的蛋