家蚕核型多角体病毒ORF71和ORF54的功能研究.pdf

1、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是专门感染家蚕（Bombyx mori）的双链环状DNA病毒.BmNPV（T3株）病毒全长128，413个核苷酸，编码136个开放阅读框(ORFs).本研究以BmNPV两个非核心基因ORF71和ORF54为研究对象，构建了基因缺失型病毒，并研究了基因缺失病毒在细胞内的复制情况、对病毒形态的影响和对宿主幼虫的感染力。主要结果如下:
　　 1.Bm71位于基因组66714-67517nt，全长804b

2、p，编码267个氨基酸残基的蛋白，预测分子量为30 kDa。在Bm71起始密码子上游434、401、288nt处发现早期转录基序CAGT，在起始密码子上游298、193、154nt处发现早期转录基序GATA，在295 nt处发现晚期转录基序TAAG.在终止密码子下游490nt处发现poly(A)加尾信号AATAAA.Bm71氨基酸序列没有预测到信号肽序列和跨膜区，但是在第116、190氨基酸处检测到N糖基化位点（N-glycosylat

3、ion sites）和第177氨基酸处的PKC磷酸化位点(Kinase specificphosphorylation sites).并且，Bm71氨基酸序列含有锌指结构域和亮氨酸拉链，此外还有一个碱性区域和一个酸性区域.预测该蛋白在宿主或病毒感染过的细胞中的亚细胞定位为宿主细胞的细胞质。
　　 2.Bm71基因起始密码子下游426bp的位置有一个PstⅠ酶切位点，用λRed同源重组方法将氯霉素乙酰转移酶基因（cat）插入该酶切

4、位点，使Bm71基因不能正常转录和表达，并利用Tn-7转座重组将绿色荧光蛋白基因egfp和多角体蛋白基因ph重组到BmNPVbacmid的ph位点，从而成功构建了Bm71基因敲除病毒.
　　 3.Bm71敲除病毒可以感染家蚕细胞，但是产生的BV滴度大大降低.与野生型病毒相比，Bm71敲除病毒杀死家蚕五龄幼虫的时间延长了约7.5个小时.而Bm71基因的异位补回能够拯救这种缺陷。Bm71敲除病毒感染的细胞内能够产生正常形态的核衣壳和

5、多角体.
　　 4.Bm54 ORF全长2，418bp，位于基因组50462-52879nt，编码分子量为93 kDa、等电点pI为5.30的蛋白。在Bm54 ORF起始密码子上游25和217nt处发现两个杆状病毒晚期转录基序(TAAG)，暗示Bm54可能是个晚期转录基因.另外，在终止密码子下游299nt处发现一个典型的poly(A)加尾信号（AATAAA）.对Bm54氨基酸序列进行分析，发现没有信号肽、核定位信号以及跨膜结构域

6、存在。但是Bm54氨基酸序列含有一个desmoplakinN-terminus domain.
　　 5.Bm54的转录时相和表达时相分析结果表明，该基因的转录产物从3 hp.i.到72 h p.i.均可以检测到，表明Bm54是一个从早期到晚期转录的基因.Bm54蛋白的表达从6 h p.i.可以检测到并持续高表达到感染后期。
　　 6.Bm54蛋白亚细胞定位结果显示，在感染后72 h，荧光集中在感染细胞的细胞质中，细胞核

7、也有微弱荧光，说明Bm54基因产物主要定位在细胞质，与前面序列分析结果一致。Bm54蛋白在病毒结构中的定位分析表明，该蛋白是ODV结构组分，定位于ODV的囊膜。
　　 7.用948 bp的cat基因替换Bm54 ORF上一段519 bp的区域，从BmNPV基因组敲除Bm54基因，Bm54上游的835 bp和下游的1，065 bp则保留下来以免影响Bm54上下游基因的转录.
　　 8.Bm54基因敲除后不能产生有感染力的B