饲养猴群中诺如病毒感染的初步探讨.pdf

1、人诺如病毒（Human Norovirus，简称huNoVs）是导致人类非细菌性急性胃肠炎的主要病因，近年来其感染导致的发病率和致死率都在不断升高。所有年龄人群对该病毒感染均敏感。虽然多数人感染诺如病毒后可自愈，但对儿童和免疫缺陷人群仍构成了严重的威胁。诺如病毒分子进化快、人群感染后持续排毒、低剂量感染及传播途径多样性等特点使得诺如病毒暴发流行较为严重，因此感染后快速确诊和及时治疗很重要。研发有效的疫苗不仅可以减轻公共卫生负担，还可以提

2、高国民经济效益和生活质量。然而，目前诺如病毒体外培养体系和体内动物模型的缺乏，给疫苗研发造成极大的阻碍。
　　本研究主要目的是通过对饲养猴群中诺如病毒感染情况的初步探索，为以后建立诺如病毒的非人类灵长类动物感染模型打下基础。为此，本论文主要进行了以下6个部分的研究：1）通过TaqMan荧光定量RT-PCR方法对某人工饲养猴群及某医院患者粪便中的诺如病毒排毒情况进行检测，检测猴群中诺如病毒排毒情况是为后期动物模型构建筛选合适动物和病

3、毒株，检测人群中诺如病毒流行情况为后期人诺如病毒感染动物实验筛选病毒株;2）选取部分阳性样品进行全基因组序列扩增，通过全基因比对可以了解诺如病毒的进化与变异;3）通过PCR扩增得到一株猴源GⅡ.17型诺如病毒的P结构域及P结构域变体基因，进行密码子优化后，在原核表达系统中诱导表达重组融合蛋白，纯化后的蛋白免疫小鼠后制备抗血清，并通过Western Blot和ELISA分析蛋白的抗原性，为后期诺如病毒感染动物后样品检测做准备;4）用含有G

4、Ⅱ.17型诺如病毒的粪便滤液在自然状态下通过口服感染健康猴子，分析感染后猴子的临床症状和排毒情况，为诺如病毒感染动物模型的构建做初步探索;5）通过ELISA方法对猕猴来源的唾液样本进行分型后，用前面表达纯化得到的P结构域及其变体蛋白进行唾液结合实验，有助于诺如病毒感染机制的研究;6)分离并初步进行猕猴肠上皮细胞的3D培养，为后期诺如病毒常规培养系统的建立及疫苗中和评价奠定基础。
　　通过以上研究，我们得到如下结果：
　　(1

5、)共检测猕猴粪便样品28例，人源粪便样品49例，诺如病毒在猕猴和患者中阳性检出率分别为28.57％、36.73％，确定了诺如病毒可以感染猕猴。
　　(2)通过RT-PCR扩增得到一株GⅡ.17型猴源诺如病毒全基因组序列，Genebank号为：KX356908。此外，还扩增获得了三株GⅡ.4型人源诺如病毒全基因组序列。
　　(3)测序结果表明，我们成功地构建了P结构域及其变体基因原核表达质粒。SDS-PAGE分析显示，诱导表达

6、P结构域蛋白在超声裂解上清和包涵体中都有，而其变体蛋白主要存在于超声裂解上清中。Western Blot和ELISA结果表明，表达纯化得到的P结构域及其变体蛋白有很好的抗原性和免疫原性。表达的蛋白免疫小鼠诱导的抗体ELISA效价达到1∶32000。
　　(4)攻毒实验结果表明，猕猴口服含诺如病毒的粪便滤液后，虽然没有出现发热、呕吐、腹泻等临床症状（这与健康成年人感染诺如病毒临床表现相一致），但是具有较为明显的粪便排毒。而且进一步的

7、ELISA分析血清中诺如病毒抗体滴度结果表明，尽管攻毒前2只猕猴血清中均有较高诺如病毒特异性抗体滴度，然而随着感染后时间的推移，ELISA效价有所增加。
　　(5)唾液表型分析发现，猕猴群中唾液表型A、B、AB、H分布比率分别为15.79％、68.42％、14.04％、1.75％。通过正交实验检测猕猴血液样本的ABO分型，发现唾液表型与血液表型相符。当用诺如病毒P结构域蛋白P-RGD或P结构域变体蛋白PΔR与唾液样本结合时并未发现

8、明显结合，需进一步实验探讨和验证结果。
　　(6)为得到肠道干细胞来源的肠细胞，我们首先通过EDTA螯合法成功分离到猕猴结肠来源肠上皮隐窝，然后通过基质胶模拟3D环境培养肠隐窝，在生长因子的诱导下可见其生长，然而肠细胞的组织形态及生长规律等特征还有待进一步的验证。
　　结论：本论文通过分析某饲养猴群和某医院诺如病毒的感染情况发现，其阳性检出率分别为28.57％和37.63％。诺如病毒全基因组序列分析表明猴群中的GⅡ.17型诺