小鼠Dlk1-Dio3印记区域内一个新的差异甲基化区的表观遗传学分析.pdf

1、小鼠Dlk1-Dio3印记区域位于12号染色体末端（12qF1），包含三个父本表达的蛋白编码基因和多个母本表达的长非编码RNA基因，以及大量的miRNAs和核仁内小RNA（snoRNAs）。已知这一印记区域内有三个父本甲基化的差异甲基化区（IG-DMR、Gtl2-DMR和Dlk1-DMR）。miR-341和miR-1188是两个前体序列相距226 bp的miRNA，位于这一印记区域内Meg8的第二内含子中。已有研究表明，腺相关病毒载体在

2、miR-341附近区域的定点整合会导致上、下游的长非编码RNA基因的表达水平显著上调，诱导肝癌的发生；而Sleeping Beauty转座子也会特异地插入到miR-341的上下游区域并引起突变，使附近基因的表达上调，促进肝癌的发生。这说明miR-341附近的插入突变会导致上下游基因的表达失调，暗示着miR-341的附近可能存在重要的DNA调控序列。CpG岛的预测表明miR-341和miR-1188的附近存在两个CpG岛（命名为CGI-1

3、和CGI-2），其中CGI-1覆盖了miR-341的前体序列，CGI-2位于miR-1188下游约800 bp处。本文以小鼠Dlk1-Dio3区域内的miR-341/miR-1188和CGI-1/CGI-2为研究对象，分析了DNA甲基化在发育过程中的动态变化、组蛋白修饰的分布以及锌指蛋白CTCF在这一区域的结合情况，并构建载体分析了新的差异甲基化区CGI-2的绝缘子活性。
　　首先，本研究分析了miR-341和miR-1188的表

4、达谱和印记状况。原位杂交的结果显示它们的初级转录本在E15.5天具有相似的表达模式，主要表达于脑、舌、肺、肝、胸腺、椎体软骨等部位；定量PCR的结果表明miR-341和miR-1188的成熟体在舌和肝中有较高的表达，脑和肺次之，肾中的表达较低，与初级转录本的表达模式是一致的；印记分析表明miR-341和miR-1188是两个母本表达的miRNAs。
　　其次，本研究分析了CGI-1和CGI-2的DNA甲基化模式及其在小鼠胚胎发育过

5、程中的动态变化。亚硫酸盐测序分析表明CGI-2在E15.5和E18.5天的各组织中是一个母本甲基化的差异甲基化区；CGI-2在精子和卵细胞中都发生了高甲基化，在着床前的胚胎发育过程中逐渐去甲基化；着床后CGI-2发生了差异性的重新甲基化，它的母本等位快速地重新甲基化并一直维持高甲基化状态，而其父本等位在部分地重新甲基化后再次发生去甲基化；CGI-2在E7.5天之前建立起差异甲基化模式。CGI-1虽然在囊胚中也发生了去甲基化，但在小鼠精子

6、、卵细胞、桑葚胚和着床后的胚胎中父母本都发生了高甲基化，并不具有等位差异性。
　　再次，本研究分析了差异甲基化区CGI-2及其上下游区域的组蛋白修饰的分布和CTCF的结合情况。ChIP实验的结果表明，组蛋白修饰H3K9me3广泛存在于CGI-2及其上下游区域；在肝脏中组蛋白修饰 H3K4me3和H3K9me3同时存在于CGI-2，但在胎盘中 CGI-2上只存在H3K9me3，缺乏激活性的H3K4me3。生物信息学预测表明在CGI-

7、2及其上下游区域共存在四个高度保守的CTCF结合位点，但ChIP的结果显示在小鼠肝脏和胎盘中CTCF实际上只结合于第三个位点，即只结合于差异甲基化区CGI-2。
　　最后，本研究构建了绝缘子分析用的系列载体，初步分析了CTCF结合的差异甲基化区CGI-2的功能。软琼脂集落形成实验的结果表明CGI-2具有绝缘子的活性，且其绝缘子活性是依赖于CTCF结合位点的。
　　综上所述，本研究发现CGI-2是小鼠Dlk1-Dio3区域内的