梅毒实验室检测技术剖析

1、梅毒实验室检测技术,,梅毒控制规划中期评估-梅毒实验室检测知识调查（1）,1.一旦感染梅毒，梅毒螺旋体特异性抗体通常会终身阳性 2.RPR/TRUST只能用于梅毒初筛3. 二期梅毒时，TPPA和RPR两种血清学试验100％阳性4.接受抗梅治疗的婴儿，随访18个月后TPPA （+）/RPR（- ）可确诊为胎传梅毒 5.常规梅毒血清学检测的是IgG抗体，不能检测到IgM抗体6.TPPA（- ）/ RPR（+）结果一般可排

2、除梅毒螺旋体感染 7. TPPA滴度检测是临床治疗梅毒效果评价的重要参考指标,2,梅毒控制规划中期评估-梅毒实验室检测知识调查（2）,8. 新生儿血清TPPA（+）/ RPR（+），可诊断为先天梅毒9.梅毒初筛可采用任何一种血清学检测方法10. RPR和TRUST的方法原理相同，所以两种方法的定量试验滴度结果一定一致11. TPPA（+）/ RPR（-）可能是极早期梅毒12. ELISA法检测阳性，TPPA复检阴性，最终结果

3、报告：TPPA试验阴性，解释ELISA法为假阳性。,3,实验室检测的目的？,早期发现临床诊断有效治疗精准医疗疫情报告,,检测方法检测策略,,结果的解读和合理应用医生、检验、防保,,结果如何解读和合理应用,,,,,,,,,,,,,,,,,,如何发挥实验室检测作用,实验室检测 实验室诊断艾滋病检测策略最新进展（2015） 确证（诊）试验 → 补充试验 阳、阴性→有、无反应 增加了各种检测

4、策略 强调临床诊断,≠,梅毒是一个可以临床治愈的传染病,病例诊断依据病史症状实验室检查实验室检查结果对梅毒诊断及判愈有决定性意义,如和达到实验室检测的基本要求,检测方法检测策略质量保证,,管理层面（行政、疾控）生产厂家医疗机构（医生、检验、防保）,常用梅毒实验室检测方法,检测方法,病原学检测梅毒螺旋体血清学试验非梅毒螺旋体血清学组织病理学检测白细胞检测蛋白检测,,未经治疗的梅毒病人的自然病程,,,

5、,感染梅毒螺旋体,一期梅毒,二期梅毒,隐形梅毒,三期梅毒,72%,30%,终生隐形梅毒,,,,,中枢神经系统感染,,28%,感染梅毒螺旋体,2-6周,1-3月,1-3月,2-50年,,,,病原学检查,原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。方法：（1）暗视显微镜检查

6、 （2）镀银染色法 （3）核酸检测（血液标本？）注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功，仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增殖。,,病原学检查的临床意义,螺旋体检查是诊断早期梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。,梅毒血清学检测方法,(1) 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 （非特异性梅毒抗体）(2)

7、 梅毒螺旋体抗原血清学试验 （特异性梅毒抗体）两类方法。问题： 为什么梅毒诊断需要上述两类血清学检测方法？,,非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理,梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。中华人民共和国卫生行业标准 WS/T491—2016:梅毒非特异性抗体检测操作

8、指南２０１６-０７-０７发布 ２０１６-１２-１５实施,非梅毒螺旋体抗原血清学原理,方法包括： （1）快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR) （2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST） （3）性病研究实验室试验 (VDRL)等。基本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见上述方法的敏感性和特异性都基本相似,非梅毒螺旋

9、体抗原血清学试验原理示意图,非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点,1、仪器：水平旋转仪，转速？转幅？,2、定性试验加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中， 并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下观察结果,？滴/mL，1滴=？ul,√,×,非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点,1、仪器：水平旋转仪，转速、转幅,2、定性试验

10、加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中， 并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下观察结果,60滴/mL，1滴=17ul,100r/min约18mm,非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点,3、定量试验稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列

11、稀释，并涂布整个圈内。 下同定性试验。,,,,,,,,,,,,,？,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,问题：定量试验原倍血清滴度是多少？,问题：定量试验血清稀释需要使用试管吗？,非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点,3、定量试验稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。

12、下同定性试验。,,,,,,,,,,,,,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,,非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。可作为梅毒筛查试验。因治疗后血清滴度可下降并阴性，故（1）可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征；（2）结梅毒螺旋体抗原血清学试验鉴别梅毒现症感染和既往感染VDRL试验用于神经梅毒脑脊液检测特异性高，

13、检测阳性可以作为神经梅毒确诊依据，但敏感性较低，即检测阴性不能排除神经梅毒。,,血清固定早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后 一期梅毒1年后转为阴性 二期梅毒2年后转为阴性。 晚期梅毒 治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。血清固定：一直保持低滴度，不转阴,非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点,,,,,,,,,,,,,1:1,1:2,1:8,1:4,1:16,非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点,前带现象,

14、,非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点,假阳性反应技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可排除。生物学假阳性反应(一般滴度小于1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA等进行排除。,梅毒螺旋体抗原血清学试验原理,抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。问题：梅毒螺旋体抗原血清学试

15、验的定量试验在梅毒诊疗中有意义吗？,梅毒螺旋体抗原血清学试验方法,梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA) 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) 梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA） 化学发光免疫分析法（CLIA） 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (RT) 荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）-IgM、IgG,TPPA,TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产

16、生可见的凝集反应，具有较高的敏感性和特异性。 TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“金标准”，常用于新方法、新试剂的参照标准。,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,明胶颗粒,梅毒抗原,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,抗原致敏颗粒,抗原致敏颗粒,血液中抗体,抗原抗体凝集,TPPA试验原理示意图,29,,4+：

17、 粒子光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠 3+： 粒子光滑覆盖大部分底 2+：粒子光滑聚集覆盖孔底，周围有一细胞环 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周围有一明显细胞环 ±： 粒子沉集孔底，中央形成一小点 –： 粒子紧密沉积孔底中央,TPPA试验结果判读,a:均为RPR阳性标本,ELI

18、SA/ CLIA,ELISA试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。本法可用于大样本血清检测。化学发光法的临床应用意义基本同ELISA化学发光法的敏感性？？,梅毒免疫层析快速检测方法（全血法）,31,梅毒免疫层析快速检测方法（血清、血浆法）,梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)初筛阳性标本的确证试

19、验，排除RPR 假阳性。不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断。不能作为疗效观察的指标。,梅毒血清学试验结果解释（梅毒临床诊断参考依据）,34,问题：此结果解释适用于先天（胎传）梅毒吗？,梅毒IgM抗体（TP-IgM）,IgM抗体的产生是感染后的早期体液免疫应答反应。IgM分子比IgG较大，所以IgM抗体不能通过胎盘屏障。而母亲的IgG抗体可以通过胎盘屏障传给胎儿。因此若在新生儿血中检测到IgG抗体不

20、能作为先天梅毒的诊断依据，而IgM抗体可为先天梅毒的诊断依据。 IgM抗体检测其特异性较高，但敏感性较低。因此，IgM抗体检测阴性，不能排除先天梅毒感染。,35,先天梅毒的诊断,先天梅毒的诊断标准梅毒暴露婴儿具有以下条件之一：暗视野显微镜检梅毒螺旋体阳性梅毒螺旋体IgM抗体阳性*RPR/TRUST检测阳性，滴度比母亲分娩前最近一次滴度高4倍及以上RPR/TRUST检测随访中，任何一次滴度不下降或反而上升

21、满18月龄后，TPPA检测阳性,36,37,,梅毒实验室检测策略,,梅毒实验室检测策略思考,,,39,非梅毒螺旋体抗原血清学试验,梅毒螺旋体抗原血清学试验,,排除试验假阳性确证梅毒螺旋体现症感染,,排除治愈的既往感染者确证梅毒螺旋体现症感染,？RPR：初筛试验 TPPA：确证试验,40,,,,41,阳性,42,,,43,阳性,梅毒筛查最佳策略,,,2015非梅毒螺旋体血清学试剂评估,45,46,2015梅毒螺旋体抗原血清学试

22、剂评估,实验室生物安全防护要求,一级生物安全防护水平：适用于第四类病原微生物二级生物安全防护水平：适用于第三类病原微生物三级生物安全防护水平：适用于第二类病原微生物四级生物安全防护水平：适用于第一类病原微生物,47,一般临床血标本处理是否需要在几级生物安全实验室操作?,梅毒实验室安全生物暴露,a) 不慎发生标本污染工作台，不要立即用水冲洗，应先用纸巾、布等敷料加上消毒液（如10%次氯酸钠，75%乙醇等）消毒30分钟以上，然后再清洗

23、。如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。b) 实验时手部污染，应立即用肥皂洗手并冲洗干净，再外用消毒药水，如误入口内，应立即吐出，并用清水反复漱口，必要时根据实际情况用药。c）被刺伤、划伤等，应先挤压后冲洗，再擦以碘酒等简单处理后，立即到医院接受青霉素治疗，同时应做梅毒血清学检测（？？）d) 出现与所检测对象引起的疾病相似症状时，立即就医。,48,梅毒控制规划中期评估-梅毒实验室检测知识调查（1）,1.一旦感染梅毒，梅毒螺旋体特异

24、性抗体通常会终身阳性 2.RPR/TRUST只能用于梅毒初筛3. 二期梅毒时，TPPA和RPR两种血清学试验100％阳性4.接受抗梅治疗的婴儿，随访18个月后TPPA （+）/RPR（- ）可确诊为胎传梅毒 5.常规梅毒血清学检测的是IgG抗体，不能检测到IgM抗体6.TPPA（- ）/ RPR（+）结果一般可排除梅毒螺旋体感染 7. TPPA滴度检测是临床治疗梅毒效果评价的重要参考指标,49,梅毒控制规划中期评估-