鸭圆环病毒ORF3基因的序列分析及基因表达.pdf

1、鸭圆环病毒(DuCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，可导致鸭的免疫抑制，对养鸭业造成危害。本研究通过DuCV ORF3的片段大小对DuCV进行了基因型分类，并通过原核表达和真核表达对ORF3的功能进行了研究。主要内容如下：
　　 ⑴鸭圆环病毒ORF3基因克隆测序及序列分析。为了解DuCV不同分离株的ORF3基因变异情况以及分析它们的同源性，本研究从临床病料中对DuCV的ORF3基因进行了克隆测序，结果获得了10株DuCV的ORF3基

2、因序列，并与GenBank登录的45株DuCV的ORF3基因进行同源性分析，结果表明所有DuCV的ORF3基因根据大小及同源性差异分为两个基因型：基因1型和基因2型。同一基因型之间的核苷酸同源性为95.8％～100％，氨基酸同源性为88.6％～100％，而不同基因型之间的核苷酸同源性仅为87.8％～91.6％，氨基酸同源性仅为72.2％～81.0％。55个毒株中的36个属于基因1型，ORF3基因大小为237bp，编码78个氨基酸的蛋白；

3、19个毒株属于基因2型，ORF3基因大小为297bp，编码98个氨基酸的蛋白。本研究获得的10株DuCV的ORF3基因9株属于基因1型，1株属于基因2型，说明当前我国流行的DuCV主要为ORF3基因1型。
　　 ⑵鸭圆环病毒FJ0601株ORF3蛋白的原核表达及其抗血清制备。本研究采用PCR方法扩增出DuCV FJ0601株ORF3基因，将其克隆入原核表达载体pET-32a(+)中，构建了DuCV ORF3基因的原核表达质粒pE

4、T-32a-ORF3，将其转入宿主菌Rosetta(DE3)Plys中进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明DuCV ORF3蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达，Western-blotting检测结果显示，该蛋白作为抗原可以与DuCV的阳性血清发生抗原抗体反应，从而首次证实了DuCV的ORF3为功能性基因，在DuCV感染宿主过程中进行了表达。将原核表达的蛋白纯化后免疫小鼠，制备了抗DuCV ORF3蛋白的血清，为后续研究奠定了基础。<

5、br>　　 ⑶DuCV ORF3基因的真核表达。采用PCR方法扩增出DuCV FJ0601株的ORF3完整基因，并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的杆状病毒转移载体pFastBacHT B中，获得重组转移载体pFast-ORF3，再将其转化DH10Bac感受态细胞，发生转座作用，通过蓝白斑筛选获得含有ORF3基因的重组杆状病毒DNA，以脂质体介导法将重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒Bacmid-OR