鸡胸腺素β-,4-串联体融合表达载体的构建及原核表达.pdf

1、胸腺素β4（Tβ4）是由43个氨基酸残基组成的多肽，最初从牛的胸腺中分离得到，随后发现，在体内其它组织中也有分布。Tβ4是动物细胞内一种主要的肌动蛋白调节分子，既不是生长因子，也不是细胞因子，但会对受损组织的再生、重塑和愈合起重要作用。此外，研究还证实Tβ4参与调节上皮形成、血管生成、抗炎等过程，并可促进创伤的愈合，可用来治疗感染引起的内毒素性休克及伴随的多器官功能衰竭，在医学中具有重要意义。虽然Tβ4有着广泛的应用前景，但由于其分子太

2、小，难于直接在大肠杆菌中表达。目前国内用于实验室及兽医临床上使用的Tβ4多为化学合成品，价格昂贵；而从动物组织中提取Tβ4，过程复杂、产量低，成分是多分子小肽混合物，存在着治疗效果差，副反应严重等诸多问题，使其应用受到限制。
　　 本课题利用大肠杆菌偏爱密码子，人工合成鸡Tβ4全长基因，结合PCR技术变换TB4基因的酶切位点，构建鸡Tβ4串联体基因克隆载体PMD18-2Tβ4；将重组克隆Tβ4基因转化入原核融合蛋白表达载体PET

3、32a（+）中；再将重组表达载体PET32a（+）-2Tβ4转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，经诱导表达，获得高纯度的Tβ4蛋白，并采用高效液相色谱和Westernblot对其进行检测和鉴定，通过脾淋巴细胞增殖实验测定其活性；旨在找一种能经济、简便获得Tβ4活性蛋白的方法，为鸡Tβ4制剂的研究和胸腺素在兽医临床的应用打下良好的基础。
　　 结果表明：
　　 1.采用大肠杆菌偏爱密码子，合成鸡Tβ4全长基因，结

4、合PCR技术构建了Tβ4的串联体克隆载体PMD18-2Tβ4，将其克隆入融合原核表达载体PET32a（+）中，通过电泳鉴定及基因测序证明融合蛋白表达载体PET32a（+）-2Tβ4构建成功。
　　 2.通过IPTG诱导，PET32a（+-）2Tβ4最适表达条件为37℃，IPTG浓度为0.5mmol/L。
　　 3.通过SDS-PAGE鉴定表明，Tβ4表达产物为可溶的，平均每克菌约可得到11.3mg目的蛋白。经液相色谱分析

5、，目的蛋白纯度可达95.56％。
　　 4.通过MTT法测定所表达的Tβ4对淋巴细胞增殖能力的影响，结果显示添加8μMTβ4组与未添加Tβ4的对照组相比，淋巴细胞殖显著增强，p<0.01。表明所表达的Tβ4可刺激淋巴细胞增殖与分化。
　　 总之，本研究通过基因工程方法人工体外成功表达鸡Tβ4蛋白，成本低、表达效率高、纯化方法简单。经体外活性检测证明，表达的重组Tβ4具有与天然Tβ4相似的生物学活性，但其具体的生物学功能及