碳酸酐酶法测定生物样品中锌含量的方法学研究及临床应用初探.pdf

目的建立一个灵敏、准确、特异、试剂稳定的碳酸酐酶自动生化分析法用于检测生物样品中的锌含量。探讨碳酸酐酶法检测锌的方法学性能并将建立的方法进行初步临床应用研究。方法制备去辅基碳酸酐酶()，并配制成浓度，以防腐，作为试剂()。探索检测血清、头发、尿液等生物样品中锌含量的标本预处理方法。进行最适实验条件探索及项目仪器参数设置：如反应类型，反应温度，检测波长，样品用量，试剂用量，各试剂加入时间，反应延滞期，读数时间等。进行重复性实验、回收实验、干扰实验、方法对比实验等方法学系列评价实验评价方法学性能。检测一定数量的甲状腺功能亢进症患者空腹血清锌浓度和一定数量的肾小球源性血尿患者的第二次晨尿标本锌浓度、尿锌尿肌酐比值，进行初步临床应用研究。对一定数量儿童的血清锌、发锌及尿锌水平进行同时检测，探讨三个指标间的相关性。结果反应缓冲液的选择：缓冲液能中和无蛋白滤液中的三氯醋酸()。在该条件下，试剂本底吸光度适中，此缓冲液作为试剂()测定锌最适合。配制底物时加入乙腈，不仅具有促溶作用，而且能使底物稳定，使保存时间明显延长。酶试剂中加入能明显延长酶试剂的保存时间。分析样品制备：在制备无蛋白滤液时，血清中加入等量％不仅能使血清中蛋白变性，而且能使锌离子解离出来；％与尿液等量混合后能使尿中蛋白质沉淀较完全，而不会引起尿蛋白定性为阴性的尿标本锌测定结果偏低。因此，选用％作为尿蛋白质沉淀剂、％作为血清蛋白沉淀剂比较合适。我们将酶试剂设置成试剂比将酶试剂设置为试剂更具有科学性，它可使锌离子与脱辅基碳酸酐酶能有足够的作用时间，有利于无活性的碳酸酐酶充分复活，使加入底物后，酶促反应的延滞期缩短。参数设置时采用两点定标，通过扣除试剂空白速率，能消除酶试剂中残留锌的干扰，即使碳酸酐酶透析时锌去除不完全，含有极微量，对锌的测定也不会产生影响。方法性能：～μ浓度范围内线性良好。血清锌批内值小于％，批间值小于为％。发样锌批内值小于％，批间值小于％。尿液锌批内值小于％，批间值小于％。血清锌回收率为％～％，平均％。发样锌回收率为％～％，平均为％。尿液锌回收率为％～％，平均回收率为为％。、、各μ、μ、胆红素μ对本法测定血锌、尿锌均无影响。血红蛋白、甘油三酯以下对本法测血清锌无干扰。发消化液中、、各μ、μ对本法测定发锌均无影响。用碳酸酐酶法()和原子吸收法()对血锌、发锌、尿锌进行分析，其回归方程分别为=、=、=，值分别为、、。检测了例甲状腺功能亢进症患者及例健康对照者血清锌水平，发现甲状腺功能亢进症患者组血清锌水平较健康对照组高，差别有意义。检测了例肾小球源性血尿患者及例健康对照者尿锌浓度、尿锌尿肌酐比值，发现肾小球源性血尿组尿锌浓度、尿锌尿肌酐比值高于健康对照组，差异有意义。对例儿童血锌、发锌、尿锌浓度进行同时检测，发现三指标间无相关性。结论我们建立的碳酸酐酶法测定生物样品中锌含量的方法，克服了化学比色法测定锌所具有的试剂空白吸光度高、干扰因素多、准确度差以及水合氯醛、氰化钾等试剂具有毒害性等方法学缺陷，具有操作简便快速、灵敏度高、准确度高、特异性强、试剂稳定等优点。各项方法学性能均达到所规定的要求，适合于自动生化分析仪检测。血清、发样、尿液经预处理后均可采用此法测锌。用我们建立的方法检测病人标本，进行初步临床应用研究，发现甲状腺功能亢进症患者血清锌明显升高；肾小球源性血尿患者尿锌浓度、尿锌尿肌酐比值升高。测定血锌及尿锌浓度对这些疾病的诊治有一定的价值。血锌、发锌、尿锌三项指标浓度之间无相关性。