抗感染金属植入物的设计制备及其抗感染效果研究.pdf

感染仍然是骨科植入物的严重并发症之一。植入体内的属异物是导致此类感染发生的危险因素所引发的一系列体内反应包括巨噬细胞功能的减弱局部免疫系统的钝化等都为病原体的增殖创造了便利的条件。此外植入物表面吸附的蛋白还能促进细菌黏附到植入物表面引发感染。过去我们大多关注对环境和个人污染的清除及围手术期全身抗生素的应用而新的策略则是针对该类感染发病的特殊机制通过植入物表面修饰改性来降低感染的风险。　　全身用药时可能会因患处血液循环受损和周围瘢痕组织的影响导致病灶处的抗生素浓度无法达到有效水平从而影响属材料植入后感染防治效果还会带来全身的毒副作用。研究证实细菌一旦被隔离在无血运的骨组织中抗生素的全身治疗很难在局部达到满意的药物浓度。而且一旦病原体附着于骨或其它生物材料表面就会产生代谢和表型的改变使病原体能够对抗生素产生抵抗和逃脱免疫监督局部较低的抗生素浓度反而有可能会成为细菌耐药性选择的动力。为了改善骨感染的治疗效果抗生素的局部给药方法得到研究与开发。其中抗生素缓释系统以其具有的药物持续性和可调控性释放特点而受到青睐。　　本项目组在前期低弹β钛合和药物控释研究的基础上对钛合表面进行规则微形态改性然后进行多巴胺涂层修饰并以其为媒介将庆大霉素明胶微球缓释系统成功构建于钛合表面通过前期的表面表征分析药物释放实验和体外抑菌实验等证实该属表面抗生素缓释系统具有微球结合牢固药物释放持续可控体外抑菌作用明显等优点。本研究主要在前期工作的基础上继续探索该属表面抗感染缓释系统的体内外生物相容性及动物感染状况下的材料植入对已发感染的控制效果。　　目的　　在前期低弹β钛合表面抗生素缓释系统成功构建的基础上进一步通过体外细胞实验和荧光染色研究多巴胺涂层修饰对成骨细胞黏附的影响及其生物相容性通过小鼠肌袋植入实验观察复合材料的体内生物相容性建立兔胫骨骨髓炎模型并最后通过兔胫骨骨髓炎模型的体内植入研究钛合表面抗生素缓释系统对于感染的控制作用从而为抗感染属植入物的研制和开发奠定理论和实验基础。　　方法　　钛合表面多巴胺修饰的细胞相容性检查:为探索多聚多巴胺涂层的生物相容性将家兔来源的骨髓基质干细胞接种于多聚多巴胺涂层修饰后的钛合表面然后分别采用定量计算和激光共聚焦显微镜定性观察的手段分析材料表面细胞的粘附、增殖情况并与未涂层材料作对比观察涂层修饰后材料生物相容性的变化。然后钙黄绿素()和碘化丙啶()溶液分别对活细胞和死细胞进行荧光染色观察细胞生长存活情况。钙黄绿素可显示胞浆显示死细胞的细胞核。采用激光共聚焦显微镜对活细胞生长形态进行观察。胞浆结构完整的绿色代表正常细胞胞浆碎片状结构不完整、细胞核红染的代表晚期凋亡细胞。　　复合材料的体内生物相容性检测:将只小鼠随机分为组组植入复合抗感染材料组植入单纯钛合材料组采取切开缝合处理。术后、、、周取材采集外周血用流式细胞仪检测淋巴细胞亚群分类和的百分比变化情况并进行组织学观察评估复合抗感染材料在体内的生物相容性。　　骨科属植入物感染动物模型构建方法:()将健康家兔只随机分为组实验组、、、组每组只对照组只。实验组动物分别在胫骨近端髓腔内注入浓度分别为&#;、&#;、&#;、&#;的黄色葡萄球菌悬液并在胫骨髓腔内置入长直径钛合棒一根对照组置入相同规格的钛合棒后注入生理盐水()分别通过大体观察、体温测量、线检查、细菌学培养、组织学观察、感染率和死亡率评价模型制备效果筛选建模所需最佳细菌浓度。　　抗感染属植入物对家兔感染模型感染控制作用评价:所有新西兰大白兔称量体重、测量体温后随机编号均匀地分为个实验组(组和组)兔左侧胫骨为实验侧用来注入菌液建立感染后行材料植入。组为实验组植入复合抗生素的属材料组为对照组植入未复合抗生素的属材料取材时间点为术后周、周和周。所有动物行胫骨侧位线检测各时间点取材后进行大体观察细菌培养和染色组织学观察。　　结果　　钛合表面多巴胺修饰的细胞相容性检查:法测定两组材料各时间点的吸光值后采用秩和检验进行统计分析分析结果显示第天两组之间材料表面细胞数量差异无统计学意义。第天未涂层组材料表面数量略高于涂层组组间差异有统计学意义((　　复合材料的体内生物相容性检测:流式细胞测定结果的方差分析显示术后第一周涂层材料组的比值同切开缝合组相比无统计学差异而未涂层材料组的比值显著低于其他两组(　　感染动物模型制备结果:模型动物在最初两周局部软组织出现肿胀体温明显升高随后降到正常。术后周影像学显示实验组动物患肢出现骨膜反应、骨坏死及髓腔纤维化等表现细菌培养显示实验组中感染程度随接种细菌浓度增高而加剧、两组感染率为％接种&#;()浓度细菌的组具有最高的成活率为%组具有最高的死亡率为%。术后周病理学观察到骨纤维化、骨坏死等典型感染表现。　　抗感染属植入物对家兔感染模型的感染控制作用评价:对实验动物的术后线随访发现周时实验组(组)与对照组(组)均有骨膜反应表现周和周时对照组的骨膜反应加重同时有骨质溶解破坏和死骨出现。细菌培养结果显示实验组骨组织和植入物培养结果一致培养板上未培养出菌落表明实验组复合材料在家兔感染模型上发挥了明显的杀菌、抑菌作用。而对照组的培养板上几乎长满了白色菌落表明对照组骨组织和植入物表面存在大量细菌两组差异明显。组织学观察结果显示实验组胫骨组织学切片镜下髓腔脂肪细胞排列规则结构完整造血细胞充满脂肪细胞间隙胫骨皮质层结构完整排列紧密细胞结构完整可见明显的细胞核存在。对照组为复合空白微球材料组动物胫骨髓腔组织病理学可见髓腔梗死及纤维化浆细胞和单核细胞积聚髓腔正常的空泡状脂肪细胞结构消失而被大量脓液占据髓腔侧及皮质骨内可见坏死骨片并且随时间延长对照组坏死骨片范围扩大。　　结论　　钛合表面多聚多巴胺涂层修饰在体外实验中会对细胞黏附造成轻微的负面影响钙黄绿素染色发现多巴胺涂层无明显的生物毒性。明胶微球的复合使材料在小鼠体内表现出良好的生物相容性。　　成功构建出骨科属植入物并发感染的动物模型该模型制备方法简单且成活率高为植入物抗感染研究提供了良好的动物模型。　　钛合表面抗生素缓释系统在兔骨髓炎模型中呈现出良好的感染治疗效果同时结合低弹钛合良好的力学相容性和表面改性修饰良好的生物相容性有望集合骨整合和杀菌两方面的优势为骨科属植入物相关感染()的防治提供有效的解决方案。