伤寒沙门菌fljA样基因的功能研究.pdf

1、目的：长期以来人们都认为伤寒沙门菌为单相菌株，即只有Ⅰ相鞭毛素编码基因fliC，最近在z66阳性伤寒沙门菌中发现了有两种鞭毛素编码基因，z66抗原编码基因(fljB：z66)和fliC，在z66抗原编码基因后存在一基因，与Ⅱ相鞭毛素编码基因簇中的fljA相似，本文目的是通过研究该fljA样基因对伤寒沙门菌鞭毛素基因fliC的表达调节作用以认识其功能。 方法：(1)分泌蛋白和菌体蛋白分析利用三氯醋酸—丙酮法提取伤寒沙门菌野生株(G

2、IFU10007)，fljA样基因缺陷株(Wt△fljA)和抗体诱导菌株(007j+)分泌蛋白，用SDS—PAGE电泳鉴定，并用Western免疫印迹分析分泌蛋白和菌体蛋白；(2)fljA样基因的表达根据fljA样基因两端序列设计引物，以z66抗原阳性伤寒沙门菌基因组为模板，通过PCR获得该基因，与表达载体pBAD/gⅢ连接后，重组体转化至大肠杆菌TG1中诱导培养，重组质粒转入伤寒沙门菌j+菌株，用L—阿拉伯糖诱导fljA样基因的表达；

3、(3)fliC基因转录水平表达分析通过实时荧光定量RT—PCR观察fljC样基因对fliC转录水平的调节；(4)fliC：：lacZ变异株的制备采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌β—半乳糖苷酶插入变异株fliC：：lacZ，设计加KpnⅠ和SalⅠ酶切位点的特异性引物，用PCR扩增获得fliC基因的上、下游同源性DNA片段，并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV—β—galactosidasevector的片段(无启动子的lacZ

4、片段)定向连接，克隆至自杀质粒pGMB151的SmaⅠ，再通过电击法转入伤寒沙门菌j+株，在含X—Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组变异株fliC：：lacZ，此菌株为翻译融合菌株；(5)fliC基因翻译水平表达分析通过测定β—半乳糖苷酶LacZ的活性来观察fljA样基因对FliC翻译水平的表达调节。 结果：(1)用SDS—PAGE电泳及Western免疫印迹鉴定分析分泌蛋白和菌体蛋白发现野生株GIFU10007表达FljB：z

5、66，抗体诱导菌007j+表达FliC：j，而fljA样基因缺陷株(WtΔfljA)同时表达FljB：z66和FliC：j。(2)PCR及序列分析证实，成功构建了表达载体pBADfljA，用0.2％的L—阿拉伯糖诱导了FljA融合蛋白的表达。把空载体pBAD/gⅢ和表达载体pBADfljA导入007j+，Western免疫印迹发现含有空载体的007j+与007j+菌的FliC：j表达没有明显差异，而含有表达载体的007j+菌几乎不表达F

6、liC：j。(3)通过实时荧光定量RT—PCR测定，发现含有表达载体的007j+菌株的fliC mRNA比007j+菌株降低了7倍左右。(4)PCR及序列分析证实变异株中fliC基因中间部分被3550bp的lacZ片段替代，表明成功构建了j抗原阳性fliC基因的lacZ插入变异株007j+(fliC：：lacZ)。(5)通过β—半乳糖苷酶测定，发现含有表达载体的007j+(fliC：：lacZ)变异株的β—半乳糖苷酶活性比007j+(f