根癌农杆菌介导的中国石竹遗传转化体系的建立及几丁质酶基因的导入.pdf

1、中国石竹(Dianthuschinensis)原产中国，是园林绿化中较好的地被材料，但在栽培过程中发现在潮湿温暖环境下，易染石竹叶斑病。几丁质酶是植物受病原菌侵染后诱导产生的，虽然植物本身未发现几丁质，但很多植物病原菌细胞壁的主要成分是几丁质，几丁质酶可抑制一些病原菌孢子萌发和菌丝生长。目前在植物抗病基因工程中，几丁质酶基因的应用效果显著，多种转几丁质酶基因植物的抗病性明显高于对照。本试验试图采用基因工程的方法，初步建立中国石竹的遗传转

2、化体系，并将玉米几丁质酶基因导入石竹，以获得抗病的石竹品种。实验结果如下： 1.建立起以叶片为外植体的高频再生体系取顶芽下第二三对叶片，以远轴面和培养基接触的方式在MS1(MS+0.1mg/LBA+1.0mg/L2,4-D)中预培养3d后，转入MS2(MS+1.0mg/LBA+0.3mg/LNAA)中分化培养，获得了68.3﹪的再生频率。 2.建立了以叶片为受体的遗传转化体系用pBI121/LBA4404对影响石竹转化效

3、率的因素进行比较试验，确定的转化条件为：切取转化受体材料在MS1中预培养3～4d。将二次活化至OD600=0.5的菌液离心，重悬于相同体积添加100μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，将预培养叶片放入其中，侵染6～8min，灭菌滤纸吸干，放入添加100μmol/L乙酰丁香酮的水中共培养(滤纸为基质)，暗培养3～4d。共培养结束后，将叶片在附加500mg/LCef的1/2MS液体培养基中轻轻振荡洗涤10min，灭菌滤纸吸干，转入MS

4、2+50mg/LKm+400mg/LCef中进行筛选分化培养，出芽后转入MS6(MS+0.5mg/LBA+0.3mg/LNAA+50mg/LKm+200mg/LCef)中进行增殖筛选。再生芽转入生根筛选培养基MS7(1/2MS+25mg/LKm)中进行生根筛选。 3.儿丁质酶基因的导入及转基因植株的鉴定在建立起的石竹转化体系上，将几丁质酶基因导入石竹，叶片平均再生率为6.9﹪，共获得25株生根的抗性植株。PCR检测显示，其中5株