TNFα在暴发性肝衰竭致肝肾综合征大鼠肾小球滤过率下降机制中的研究.pdf

目的:　　肝肾综合征()的主要发病机制是肾小球滤过率()明显下降。已知肾小球系膜细胞()收缩引起的肾小球滤过面积减少和肾小球入球动脉平滑肌细胞()收缩引起的肾小球血液灌注降低，均可使下降。而、收缩又与胞浆游离浓度([])升高密切相关。Ⅰ型，，三磷酸肌醇受体（）是细胞内重要的释放通道，因此是我们的研究指标。肿瘤坏死因子α(α)是单核巨噬细胞产生的具有多种生物学活性的细胞因子，是引起重症肝病发生发展的主要因子。α与结合后通过α途径使、内过度表达。而通过磷脂酰肌醇，二磷酸磷酸化，使及中产生增多，与结合后引起胞内钙释放，胞浆[]升高。时血中α水平异常升高，α是否参与了、收缩，从而引起下降尚不清楚。氨基半乳糖()联合脂多糖()诱导暴发性肝衰竭()大鼠构建模型，采用微渗透泵植入方法，用作为标记物测定，检测肾组织中蛋白及表达。然后分别用抗α单克隆抗体、氨基乙基二苯硼酸盐()阻断α、，再测定此时血中α水平及，观察α在其中的作用，为研究时下降的发病机制提供理论依据。　　材料与方法:　　、材料　　选择级别雄性大鼠，体重&#;。实验前分笼饲养，室温&#;℃，每隔开灯照明，普通饲料，自由饮水，饲养一周后用于实验。　　、方法　　()构建模型:尾静脉注射()、（μ）的生理盐水溶液。分别在给药后、、、、、、采集血液，然后离心(，℃，)，取μ上清液用于肝肾功能生物化学指标检测，其余血清℃保存用于检测细胞因子α、内皮素()。剪取部分肝肾组织置于组织固定液中，用于病理学检查，其余组织℃保存。　　()分组:分组:，、、、、、、，、、、、、、、、、、、、分组:组、组、组、组分组:组、（组）、（组）、(组)、α(组)、(组)。　　()测定血清丙氨酸氨基转移酶（）、尿素氮()、肌酐()、钾离子()、钠离子()、氯离子()应用酶联免疫吸附实验方法测定血清α、水平。　　()肝组织常规染色，光镜下观察肝细胞坏死情况电镜下观察肾组织结构是否发生改变。　　()根据肝肾功能损害及肝细胞坏死情况，确定阻断时间点为建模后。　　()将注有溶液的微渗透泵植入大鼠腹腔，第天构建组、组、组、组模型（每组各设置只大鼠），后采集血液，应用荧光分光光度计测定血清荧光量，根据公式=[]计算，(&#;)，(&#;&#;)，（&#;&#;）。结合之前检测结果，确定建模成功。　　()应用、方法检测肾组织中蛋白及表达情况。　　()将注有溶液的微渗透泵植入大鼠腹腔，按照分组在植泵后第天建模，其中组、组分别在建模前尾静脉注射抗α单克隆抗体、，后采集血液、肝肾组织标本。　　()应用荧光分光光度计测定血清荧光量，根据公式=[]计算(&#;)(&#;&#;)(&#;&#;)观察抗α抗体、对的影响。　　()应用、方法检测分组各实验组大鼠肾组织蛋白及表达情况，研究抗α抗体、对表达的影响。　　()测定分组各实验组大鼠血清α、水平，观察抗α抗体、的阻断特异性。再测定、、、、、水平，肝组织进行病理学检查，观察抗α抗体、对肝肾功能及肝细胞坏死的影响。　　结果:　　、血清肝肾功能生物化学指标及细胞因子检测结果　　组、、、α、均在给药后明显升高达到峰值，与对照组相比均有显著性差异(＜)，并且在时间点组上述五项指标分别与组、组比较，均有显著性差异(＜)，从客观上除外、药物本身对五项指标的影响。浓度分别在给药后、各出现一次峰值，浓度在给药后明显降低，与对照组比较均有显著性差异(＜)浓度无明显变化。　　、肝肾组织学病理检查结果　　肉眼观察联合给药后肝脏呈酱紫色，充血肿胀，弥漫出血点，切面有暗红色淤血或黄色乳糜状坏死物质溢出。光镜下肝细胞大块坏死，没有肝细胞再生，纤维间隔塌陷，充填大量红细胞。电镜下观察肾小球、近曲小管、远曲小管结构均正常。　　、组、组、组、组结果　　组与组比较明显降低，降至组的％，有显著性差异(＜)。组再分别与组、组相比，差异均有显著性(＜)。　　、半定量分析蛋白表达　　对照组蛋白表达水平较低组从开始蛋白表达增加，以最为明显，与对照组比较有显著性差异(＜)。在时间点组蛋白表达水平分别与组、组比较，均有显著性差异(＜)。　　、分析表达　　联合给药后表达增加，以最明显，与对照组相比有显著性差异(＜)。在时间点组表达水平分别与组、组比较，均有显著性差异(＜)。　　、组、组计算结果　　组、组的与组比较明显增加，有显著性差异(＜)与对照组比较，组、组校正后的(，)比校正前()更接近正常水平。再将组与组进行组间比较，无显著性差异(＞)。　　、半定量分析抗α抗体、对蛋白表达的影响　　联合给药后及组蛋白呈高水平表达，两者之间无显著性差异(＞)而组蛋白表达明显减少，与组比较有显著性差异(＜)组、组进行组间比较有显著性差异(＜)。　　、分析抗α抗体、对表达的影响　　联合给药后表达明显增加，组表达明显下降，两者比较有显著性差异(＜)而组表达水平与组相近，差异无显著性(＞)。　　、抗α抗体、对肝肾功能生物化学指标及细胞因子水平的影响　　组、组的、、水平与组比较均明显降低，有显著性差异(＜)组降低％，组降低％，两者比较，差异有显著性(＜)，而、降低程度两者相比无显著性差异(＞)组出现明显高钾、低钠、低氯血症，而组、组、、浓度均恢复正常，再将组、组进行组间比较，无显著性差异(＞)。　　、抗α抗体、对肝细胞坏死的影响　　组肝细胞呈点状或小灶状坏死，组肝细胞呈明显灶状或小片状坏死。　　结论:　　、联合打击大鼠，在动物水平模拟了人的部分病理生理过程，成功构建动物模型。　　、联合打击后肝肾功能损害及肝细胞坏死最严重，下降最明显，因此是成模时间点，也是我们选择的阻断时间点。　　、时蛋白表达明显增加，其上调时相与血中α、升高时相一致。　　、蛋白表达在转录水平受的调控。　　、抗α抗体预先阻断后，大鼠肾脏蛋白及表达明显减少，却显著增加，揭示了α是通过上调蛋白及表达，导致降低。　　、预先阻断后，虽然大鼠肾脏蛋白及表达无明显降低，但是却显著增加，表明对降低的改善，不是由于下调蛋白及的表达，而是由于有效地阻断了的活性。同时也揭示了是肾脏内影响的重要信号转导通路之一。　　、抗α抗体、对于改善肾脏功能效果相近。　　、抗α抗体在减轻肝细胞坏死，改善肝功能方面明显强于。　　、体重、肾脏重量校正后的能更准确地反映肾小球滤过功能，并且两种校正方法的比较结果相似。