雌激素通过α-受体亚型途径促进内皮祖细胞增殖和迁移.pdf

1、目的:观察17β雌二醇(17β-estradiol,E2)及其受体激动剂PPT(选择性雌激素受体(ER)α激动剂)、DPN(选择性雌激素受体(ER)β激动剂)对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells EPCs)增殖和迁移的影响。探讨E2可能通过何种ER亚型起作用。
　　 方法:(1)脐带血单个核细胞的分离:抽取健康足月孕产妇胎盘脐带血60ml,按20U/ml加入普通肝素抗凝,采用明胶沉淀联合密度梯度

2、离心法分离获得单个核细胞,并进行细胞活力计算(死细胞着蓝色、活细胞不着色),活细胞占98％以上可进行接种,上述过程在四个小时内完成。(2)诱导分化:将细胞以4×106/cm2密度接种于纤维连接蛋白包被的25cm2培养瓶中(4μg/cm2),加入5ml M199培养基,添加10％胎牛血清、1％青链霉素(1万单位/ml)、VEGF50ng/ml、b-FGF1ng/ml,置于5％CO2、饱和湿度、37℃孵育箱中,成纤维细胞多于24小时以内贴壁

3、,24小时后取未贴壁细胞继续培养至第四天,用磷酸盐缓冲液洗掉未贴壁细胞,加培养液培养至第七天,进一步用磷酸盐缓冲液洗掉未贴壁细胞,贴壁细胞供试验用。(3)EPCs鉴定:取细胞爬片先后加入硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)孵育,荧光显微镜观察；7d的EPCs进行CD133免疫荧光鉴定。(4)研究E2、PPT和DPN对EPCs增殖及迁移的影响。培养的EPCs分别加入不

4、同浓度的E2、PPT和DPN进行细胞增殖实验分析(WST)、显微镜下EPCs计数和流式细胞技术检测EPCs细胞周期。另外将EPCs细胞悬液接种于Coster Transwell(膜直径6.5mm,孔径8um)的上层,下层加入600ul的培养液,并分别在培养液中加入不同浓度的E2、PPT和DPN孵育24h(实验均设双复孔)。于高倍镜下计数定向迁移至滤膜下表面的细胞数目,研究E2、PPT和DPN对细胞迁移的影响。
　　 结果:(1)

5、培养3-4天的单核细胞开始贴壁；7天后呈簇状生长,并有一定方向性；9天可见多个血岛样细胞团出现。免疫荧光鉴定显示>90％的贴壁细胞呈双荧光染色阳性,CD133免疫荧光检测显示绿色阳性率>90％。(2)WST实验分析发现E2及PPT能促进EPCs的增殖,呈浓度依赖性,而DPN对EPCs的增殖无明显影响。E2在1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7 mol/L浓度下,450nm吸光光度值分别为

6、0.3466±0.0132、0.5083±0.016、0.5397±0.020、0.4785±0.0189；PPT在同等浓度下其吸光光度值为0.3265±0.1290、0.4503±0.0210、O.5040±0.0161、0.4272±0.0220,各浓度的E2组和PPT组与空白对照组0.2961±0.0106相比有明显统计学意义(P<0.05)；DPN在同等浓度下其吸光光度值为0.2963±0.0141、0.3129±0.0483、

7、0.2951±0.013、0.3016±0.0241,与空白对照组相比无统计学意义(P>0.05)；同等浓度的E2及PPT与DPN组相比有明显统计学意义(P<0.05)；同等浓度的E2与PPT相比有明显统计学意义(P<0.05)。(3)手工计数显示E2及PPT作用后EPCs数增多,在1×10-8mol/l浓度下分别为(2.83±0.29)±105个、(2.56±0.11)×105个,与对照组(2.21±0.09)×105个相比有明显统计

8、学意义(P<0.05),DPN(2.21±0.99)x105个与空白对照组无统计学意义(P>0.05)； E2、PPT与DPN组相比有明显统计学意义(P<0.05)；E2与PPT相比有统计学意义(P<0.05)。(4)细胞周期实验表明E2及PPT作用后,S期的EPCs所占百分比为(17.26±3.89)％、(12.1±1.84)％,分别与空白对照组(2.93±0.15)％相比有明显统计学意义(P<0.05),DPN(3.37±0.64)

9、％与空白对照组相比无统计学意义(P>0.05)；E2作用后G1期细胞所占比例为(72.5333±6.2645)％,分别与对照组(87.2667±7.9758)％、DPN(87.6±0.7104)％相比有明显统计学意义(P<0.05),E2与PPT(77.3±5.2602)％相比无统计学意义(P>0.05)(5)细胞迁移实验表明E2及PPT能促进EPCs的迁移,浓度在1×10-8mol/l时作用最强,E2在1×10-10mol/L、1×1

10、0-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L浓度下迁移至下层细胞数分别为35.64±4.9、44.26±3.93、50.10±6.22、39.81±4.73个,PPT在同等浓度下为29.00±3.61、40.06±4.68、43.47±4.78、35.18±2.71,与空白对照组相比18.78±1.35个相比有明显统计学意义(P<0.05)；DPN为18.97±2.01个、22.13±4.14个、24.72±3.43