黄连素调节NF-κB信号通路抗糖尿病小鼠肾损伤的研究.pdf

1、研究背景： 糖尿病肾病(Diabeticnephropathy，DN)是糖尿病(Diabetesmellitus，DM)慢性微血管并发症之一，是导致终末期肾衰竭的主要原因，严重影响了患者的生活质量和危害患者的生命健康。DN的发病机制非常复杂，尚未完全清楚，目前认为是多种复杂的因素，如糖代谢异常，肾脏血流动力学、蛋白质非酶糖基化、氧化应激、多元醇通路激活、遗传易感基因等综合作用的结果。近年来大量研究发现糖尿病及糖尿病肾病肾脏组织中

2、伴有大量的炎性细胞浸润，炎症因子的异常表达，提示炎症反应参与了DN的发病。越来越多的研究显示NF—кB的激活与DN的发生及发展密切相关，其作为糖尿病肾病发病机制的一个许多相关途径中的中心因子，对高血糖状态下的肾脏结构、功能的改变起重要作用，NF—кB激活后可调控多种炎性因子，细胞因子的表达，从而参与肾脏的炎性损伤。ICAM-1为介导单核细胞浸润肾小球及间质关键的黏附分子，纤维化因子TGF—β1在DN中的主要生物学作用是促进肾脏细胞肥大和

3、影响ECM的代谢，目前的研究认为TGF—β1表达增加为肾小球系膜外基质增生进而导致肾小球硬化及间质纤维化的主要原因。且研究报道发现ICAM-1，TGF—β1均含有NF—кB的结合位点，受NF—кB的调节。FN为细胞外基质主要成分，其表达异常增加主要表现为系膜基质增加，直接导致肾小球硬化。 黄连素是从小檗属植物黄连、黄柏根茎中提取出的一种异喹啉类生物碱，已作为抗菌，抗病毒治疗细菌性痢疾，肠道感染广泛应用于临床，另外还有报道其具有降

4、血糖、降血脂、降血压等药理活性。本课题组前期的实验研究表明黄连素对糖尿病大鼠的肾损伤具有明显的改善作用，其机制与黄连素调节P38MAPK信号通路等有关。对高糖培养的肾小球系膜细胞细胞外基质成分FN表达的抑制作用，黄连素各组明显优于P38MAPK特异性抑制剂(SB352580)组，提示黄连素除影响P38MAPK信号通路外，还可能通过干预调节其它信号通路来影响细胞外基质FN的生成。鉴于NF—кB通路激活诱导的炎性反应在糖尿病肾病发病中的重要

5、作用，黄连素在调节P38MAPK信号通路基础上是否进一步抑制了NF—кB的激活以减轻肾脏炎性反应、阻抑糖尿病肾病的发生、发展？值得进一步探讨研究。 基于此，本课题构建四氧嘧啶诱导的糖尿病肾损伤小鼠模型，观察黄连素对糖尿病肾损伤小鼠肾功能的保护作用，以及其对糖尿病肾损伤小鼠肾脏NF—кB激活，下游ICAM-1，TGF—β1以及FN的蛋白表达的影响来深入探讨黄连素抗糖尿病肾病作用机制，为下一步体外实验打下基础。 研究目的：

6、 1、观察黄连素对四氧嘧啶(Alloxan)诱导的糖尿病小鼠肾损伤的保护作用。 2、观察黄连素对四氧嘧啶(Alloxan)诱导的糖尿病小鼠肾损伤模型的肾脏的NF—кB激活，ICAM-1、TGF—β1及FN的蛋白表达的影响。 研究方法： 选取40只C57BL/6雄性小鼠，SPF级，23±2g，采用200mg/L四氧嘧啶(Alloxan)单次腹腔注射造糖尿病模型，血糖>11.1mmol/L为造模成功动物。将其分

7、为模型组，黄连素给药组，每组各8只，黄连素使用0.5％的羧甲基纤维素钠溶液配制，剂量为0.3g/kg。选取未经造模的正常小鼠8只为正常对照组，正常组及模型组给予等体积的0.5％的羧甲基纤维素钠溶液。实验观察周期为期12周，实验结束时称体重，取血检测肾功能相关指标：血糖(FBG)，血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、24h尿蛋白(UP24h)，解剖取双肾称重、计算肾脏肥大指数；取部分肾组织常规方法制备石蜡切片，作HE染色观察各组肾脏病理

8、改变；使用免疫组化方法观察各组肾组织肾小球NF—кB(P65)的胞核表达情况；Westernblot方法检测各组肾组织IкB—α、ICAM-1、TGF—β1及FN蛋白表达。 研究结果： 1.实验12周时，模型组与正常对照组相比，体重明显下降，肾重/体重(肥大指数)、血糖、BUN、Cr、UP24h均明显升高(P<0.05)；黄连素给药后可显著改善模型小鼠的肾脏肥大指数与肾功能指标。(P<0.05)。 2.病理观察结

9、果显示：与正常组比较，模型组小鼠肾小球肥大，基质增生，肾小球内皮细胞与外肾小囊粘连；黄连素给药后，可明显减轻上述病理改变。 3.免疫组化结果显示：模型组小鼠肾小球内NF—кB(P65)核染色百分含量较正常组明显增加(P<0.05)，黄连素组NF—кB(P65)在肾小球内核染色明显减少(P<0.05)； 4.Westernblot结果显示：模型组小鼠肾脏IкB—α降解明显(P<0.05)，黄连素给药后显著抑制其降解(P<0