基于DNA芯片技术的微生物检测方法研究.pdf

1、基因芯片可以实现生物样本的高通量并行检测，在基因表达谱检测、基因多态性分析、疾病快速诊断、以及微生物检测等方面有着广泛的应用。微生物快速检测是传染性疾病诊断和治疗、食品卫生和安全以及环境监测的关键。细菌培养法、抗体检测法等微生物检测的经典方法存在着培养周期长、某些微生物种群培养条件苛刻等问题，而且检测通量低、质量控制难。基因芯片技术为建立快捷高效的微生物检测提供了全新的技术平台。本论文以基因芯片技术为技术平台，发展了4种新型的微生物检测

2、方法：基于滚环扩增(rollingcircling amplification，RCA)的基因突变检测芯片技术、基于单荧光标记的定量PCR检测芯片技术、基于电化学的定量PCR检测芯片技术以及新一代高通量DNA测序技术。
　　 1．基于滚环扩增的基因突变检测芯片技术。该技术设计了液相RCA核酸探针和固定检测探针等二类核酸探针来并行地检测微生物基因组上不同单碱基突变位点。液相RCA核酸探针包括四个片段区域：引物区、固定区、模板区和探

3、针区。当探针两端的序列与待检序列严格互补时，在T4 DNA连接酶作用下连接成环。通用引物与探针引物区杂交延伸，在Φ29DNA聚合酶作用下等温扩增产生一条长的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。扩增产物与固定在载玻片表面的固定探针杂交，同时通过与荧光探针杂交检测基因突变位点。RCA探针上的探针区，可与通用的荧光探针杂交。本文应用RCA扩增芯片技术检测了艾滋病病毒克隆文库(c-DNA)的基因点突变。该方法能够准确地检测出等主要的HIV病毒POL

4、，基因的变异位点K65R，V108I，M184V。RCA扩增芯片结合了连接酶的高准确性和基因芯片的高通量性的特点，在病毒基因点突变的高通量检测方面有一定的应用前景。
　　 2、基于单荧光标记的定量PCR检测芯片技术。该技术提出了一种新的能够高通量定量检测靶基因的生物芯片技术。在固定有若干单荧光标记核酸探针的芯片表面上对靶基因进行多重PCR扩增，同时靶基因特异性地杂交结合在固定核酸探针上在Taq酶的作用下对探针上的荧光基团进行切割

5、，实现了在片多通量定量PCR检测。根据PCR动力学原理，推导出初始模板量与探针荧光衰减率之间的定量关系，绘制出芯片多重定量PCR标准曲线。本文对该芯片多重PCR体系优化，提出了实时芯片荧光信号的修正方法。该技术采用了单荧光标记的荧光探针，避免了TaqMan探针采用的荧光能量传递原理，降低探针的荧光背景，减少了芯片的制备成本。
　　 3、基于电化学的定量检测芯片技术。本文提出了一种基于电化学检测原理的DNA芯片定量检测技术。将DN

6、A探针修饰到电极表面构成DNA修饰电极，电极表面的DNA探针分子与靶序列进行特异性杂交，形成双链DNA，通过具有电活性的杂交指示剂来识别。利用氨基乙硫醇(AET)在金电极上组装单分子层(SAM)，共价键合DNA分子固定到单分子层上，成功地制得DNA修饰电极。以[Co(phen)3](ClO4)3作为指示剂来检测循环伏安曲线(CV)，通过CV峰值的变化和标准曲线比较来估算待测基因的含量，从而进行该种微生物的定量检测。论文对单增李斯特氏菌中

7、编码毒性因子LLO的基因Hly进行检测，通过CV峰值的变化和标准曲线比较，计算样品中Hly基因的含量来确定单增李斯特菌丰度，从而确定样品中单增李斯特氏菌的污染情况。
　　 4、新一代高通量DNA测序技术。应用SOLiD高通量DNA测序技术探索了微生物分布的检测方法。即不通过微生物分离，直接通过微生物16SRNA基因测序，研究微生物的种群结构。在提取微生物种群的总DNA后，制备整个种群的16SRNA基因文库，然后进行高通量的测序，

8、从整体上对样品群落进行分析。本文以鄱阳湖某一水域中细菌种群为研究对象，提取该地区的水样中所有细菌的DNA；通过通用的16SRNA引物进行PCR扩增，使用SOLiD测序平台进行DNA测序。为了保证样本扩增中DNA拷贝数的真实性，PCR循环次数为10次。对于SOLiD测序得到的大量短片段序列信息，采用了两种方法进行处理。一是把SOLiD测序得到的读长35bp的序列先拼接成读长50bp以上序列，然后再与NCBI数据库比对，确定这些细菌的种类及