2023年全国硕士研究生考试考研英语一试题真题(含答案详解+作文范文)_第1页
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文档简介

1、Thanatin最初是从半翅目昆虫刺肩蝽(Podisus maculiventris)的血淋巴中分离的,它与蛙brevinins、蜂毒素和鲎肽素等抗菌肽相似也是通过诱导产生的。Thanatin是第一个发现在生理浓度下对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及丝状真菌有广谱抗菌活性的昆虫抗菌肽,它对于临床多重耐药菌如产气肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌也具有抗菌活性。此外,Thanatin转基因水稻具有抵抗稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的能

2、力,推测是由于 Thanatin在感染的最初阶段抑制了稻瘟病菌的活性。Thanatin由21个氨基酸组成(GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM),它的中心是一个β折叠结构,由二硫键维持。从第8位氨基酸残基(I8)到C末端形成反向平行的β折叠,两个半胱氨酸残基(Cys11,Cys18)形成一个二硫键,C末端带强阳离了,这些结构与蛙皮肤分泌的抗菌肽brevinins家族相似。结构活性关系研究指出4个结构域对Thanatin的生物活性是

3、重要的:(1)C末端袢;(2)C末端3个氨基酸残基;(3)N末端伸展的7个疏水性氨基酸残基;(4)N末端3个氨基酸残基。其中C末端3个氨基酸对革兰氏阴性菌和一些革兰氏阳性菌的抗菌活性起关键作用。N末端3个氨基酸对稳定反向平行的β折叠结构很重要,而且对抗真菌活性是必需的。为了研究结构-效应关系,将Thanatin基因序列随机突变,结果表明维持反向平行的β折叠形成C末端袢的氢键结构对于大肠杆菌的抗菌活性是至关重要的。改造Thanatin的结

4、构,在半胱氨酸侧链上用基团CH3、C2H5、C8H17修饰,研究Thanatin抗菌活性的改变。经C8H17基团修饰后,Thanatin对藤黄微球菌的抗菌作用优于野生型,提示半胱氨酸侧链的疏水性与抗菌活性之间有平行关系。将Thanatin中形成分子间二硫键的两个半胱氨酸残基间的叔丁酰基团改造成C11tBu/C18tBu,对革兰氏阳性菌如藤黄微球菌的抗菌作用增强但是对于革兰氏阴性菌如大肠杆菌的抗菌作用则下降。这些结果表明二硫键的形成不仅对

5、Thanatin的抗菌活性是必不可少的,而且对于不同细菌抗菌作用的特异性也密切相关。Thanatin对大肠杆菌的抑制作用与C末端的β折叠结构有关,而对藤黄微球菌却与β折叠结构没有直接关系而是与侧链的疏水性密切相关。
   抗菌肽天然来源有限,提取和纯化比较困难,限制了抗菌肽在医药、食品、畜牧业和农业等方面的广泛应用。利用基因工程的方法在细菌中表达抗菌肽是目前最为简单和廉价的方式。但是抗菌肽直接在大肠杆菌中表达需要面临很多问题,如

6、抗菌肽对宿主细胞的毒性、小分子肽容易被蛋白酶降解。因此抗菌肽通常以融合蛋白的形式表达以提高稳定性。然而将抗菌肽从融合蛋白中切割分离出来将会面临很多困难。重组融合蛋白通常用溴化氰、羟胺、肠激酶等切割,这些方法会在抗菌肽的末端残留不需要的氨基酸残基,影响抗菌肽的氨基酸组成和空间结构,导致抗菌肽的生物活性下降或完全丧失。而且,抗菌肽的氨基酸组成大都在12~50个左右,分子量也在4KD左右,融合表达后蛋白酶的去除纯化步骤复杂。
   由

7、于Thanatin结构简单,通过大肠杆菌表达系统表达后不改变Thanatin的一级结构和空间构象。为了研究在大肠杆菌ER2566中表达的抗菌肽Thanatin的抗菌活性,我们将Thanatin基因与内含肽(Intein)融合表达,通过DTT诱导内含肽的高效自身剪切,可获得纯化的单体Thanatin目的蛋白。实验中我们将Thanatin基因与内含肽的C末端连接,构建原核表达载体pTYB11-Thanatin,转化大肠杆菌ER2566,通过

8、IPTG诱导使Thanatin与内含肽融合表达。内含肽能与几丁质特异性的结合,通过亲和层析,融合蛋白结合在几丁质树脂上。在DTT和半胱氨酸的作用下可诱导内含肽的自身剪切,目的蛋白从融合蛋白中切割分离出来,经洗脱可以得到可溶性的目的蛋白而且没有源自载体的额外氨基酸残留,充分保证抗菌肽Thanatin完整的结构和生物活性。整个纯化过程中没有使用蛋白酶,步骤简单易行。
   大肠杆菌是肠道中大量存在的一种正常菌群。随着三代头孢菌素等抗

9、生素的广泛使用,大肠杆菌已成为医院内感染的重要病原体。由于产超广谱β内酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)大肠杆菌的存在,引起对抗生素严重的耐药性,导致病人治疗难度增加、治疗费用加大,甚至引起死亡。ESBLs是一种质粒诱导的水解酶类,它可以水解一代和二代的头孢菌素、青霉素、广谱头孢菌素和酰胺类抗生素,克拉维酸盐和舒巴坦可以抑制它的活性。ESBLs的存在是临床上β内酰胺类抗生素对于革兰氏阴性菌

10、产生耐药性的最重要的因素。携带ESBLs的质粒通常含有其它的耐药基因如氨基糖苷类抗生素抑制基因,导致产生多重耐药的革兰氏阴性菌,尤其多见于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌。在抗生素的选择性压力下,含有ESBLs的细菌能够产生新的耐药机制,并且通过质粒的转化和转导可以在不同的菌株间快速传播,可导致医院内感染的大爆发。因此,应用不同的杀菌机制生产新的抗生素或替代物有深远的意义。作为一种抗菌肽,Thanatin是通过抑制细胞呼吸来发挥抗菌作用的,并对

11、产ESBLs细菌的抑制方面表现出显著优势,将来有望发展成为抗生素的替代物。
   目的:
   1.Thanatin在原核表达系统中的表达和纯化;
   2.大肠杆菌表达的重组Thanatin抗菌活性的检测;
   3.对原核表达纯化的Thanatin应用前景的评价。
   方法:
   1.将Thanatin基因序列的原始密码子改造为大肠杆菌偏爱密码子,设计一对相互重叠的引物,采用SOE

12、法人工合成Thanatin基因并扩增Thanatin基因片段;
   2.利用连接反应构建pMD 18-T-Thanatin重组质粒,并进行测序分析;
   3.将Thanatin基因与内含肽的C末端连接,利用酶切、连接反应构建原核表达质粒PTYB11-Thanatin并对重组质粒进行测序鉴定:
   4.将重组质粒PTYB11-Thanatin转入大肠杆菌ER2566中,用IPTG诱导表达;
   5.

13、优化pTYB11-Thanatin/ER2566的表达条件;
   6.应用几丁质吸附柱亲和层析法纯化目的蛋白Thanatin;
   7.将纯化后得到的Thanatin采用标准琼脂孔穴扩散法,以耐药绿脓假单胞菌、耐药产毒大肠杆菌、0-157大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌、嗜麦芽黄单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌以及110株大肠杆菌临床标本为试验菌株,测量抑菌圈直径;
   8.

14、比较80株产ESBLs大肠杆菌和30株敏感大肠杆菌的抑菌圈直径大小的差异,使用SPSS 13.0软件应用两样本,检验进行统计学分析;
   结果:
   1.克降了Thanatin基因并成功构建PTYB11-Thanatin原核表达载体;
   2.在大肠杆菌ER2566中融合表达Thanatin重组蛋白,重组蛋白主要以可溶形式表达;
   3.通过几丁质吸附柱亲和层析得到纯化的目的蛋白Thanatin;

15、
   4.纯化后的Thanatin对临床革兰氏阴性菌有明显的抑制作用,对于临床耐药菌如耐药绿脓假单胞菌、耐药产毒大肠杆菌、O-157大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌、嗜麦芽黄单胞菌和真菌如白色念珠菌以及产ESBLs大肠杆菌有明显的抑菌活性。但是Thanatin对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌没有抑菌活性。
   5.纯化后的Thanatin对110株大肠杆菌临床标木进行体外抑菌试验,数据结果

16、经SPSS13.0软件进行统计学处理,采用两样本t检验方法,结果表明Thanatin对于80株产ESBLs大肠杆菌和30株敏感的大肠杆菌的抑菌作用没有显著性差异(P>0.05),产ESBLs大肠杆菌的抑菌圈直径为0.754±0.190cm,敏感的大肠杆菌的抑菌圈直径为0.750±0.173cm。
   结论:
   1.通过Thanatin基因与内含肽的C末端连接构建的PTYB11-Thanatin质粒,转化E.coli

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