一种新的干眼病模型—高渗盐水点眼小鼠干眼病模型的建立与评估.pdf

背景与目的：　　干眼病()又称角结膜干燥症()或者泪液功能不全综合征()是指任何原因引起的泪液质和量的异常或动力学异常导致泪膜稳定性下降并伴有眼部不适导致眼表组织病变为特征的疾病总称是最常见的眼表疾病。干眼病严重影响患者的生活质量。　　干眼病发病机制复杂多种因素均可以导致干眼病。美国眼科研究所干眼病研究小组将干眼病分为泪液生成不足型(包括()&#;&#;综合症和非()&#;&#;综合症泪液分泌不足)和泪液蒸发过强型。目前虽然有许多种干眼病模型但是至今尚无一种动物模型可以准确模仿出该病频繁发生逐渐恶化机制复杂的特点。虽然干眼病诱发因素众多机制复杂但是该病发生的共同最终通路是泪膜不稳定泪液中电解质浓度升高导致泪液渗透压升高。泪液的高渗透压是干眼病发病机制中的关键因素。　　研究表明正常人泪液渗透压是&#;干眼病患者泪液的渗透压是&#;。用作为干眼病的诊断指标其总体准确度优于其它任何一项干眼病诊断指标。　　本研究通过用高渗盐水给小鼠点眼提高泪液的渗透压制作泪液高渗透压性干眼病模型观察是否可以引起和干眼病类似的体征和组织病理学损害初步探讨泪液高渗透压在干眼病发病中的作用。　　方法　　动物的选择与分组～周龄雌性小鼠只用随机数字表法分为空白组(只)、对照组(只)、实验组(只)双眼取用。对照组采用氯化钠溶液点眼每天次实验组采用氯化钠溶液点眼每天次空白组不点眼。　　Ⅰ实验在裂隙灯显微镜下用显微镊夹住酚红棉线置于小鼠眼睛的外眦部秒后取出测量酚红棉线湿润的长度。　　角膜荧光素染色和评分使用微量加液器在小鼠下方结膜囊内滴入μ％荧光素钠溶液分钟后在裂隙灯显微镜下采用钴蓝光检查并照相记录和评分。　　角膜虎红染色使用生理盐水浸湿的虎红试纸将浸湿的部分轻轻接触小鼠的角膜。在裂隙灯显微镜下照相和记录。　　泪液蕨类实验用毛细玻璃管采集小鼠下穹隆部泪液涂在洁净的玻片上室温干燥小时内在光学显微镜下进行蕨类结晶图像分析并照相记录。　　角膜上皮和结膜上皮的组织学观察采用染色在光镜下观察角膜上皮形态用图像分析软件测量中央角膜上皮厚度。取上方穹窿部结膜采用染色在光镜下观察上方穹窿部结膜上皮的形态。计算每个高倍视野下结膜杯状细胞的数量。　　扫描电子显微镜观察在第天用扫描电子显微镜观察角膜上皮的形态。　　统计学方法采用检验比较同一时间点三组小鼠的角膜荧光素染色评分。采用秩和检验比较同一组不同时间点角膜荧光素染色评分。采用完全随机设计资料的方差分析比较同一时间点三组的角膜上皮厚度、泪液分泌量、结膜杯状细胞数量。采用检验比较同一组不同时间点的角膜上皮厚度泪液分泌量结膜杯状细胞数量。　　结果　　Ⅰ实验第天空白组、对照组、实验组的酚红棉线浸湿长度未见统计学差异(＞)。从第天开始实验组酚红棉线浸湿长度和第天比较明显减少(＜)。第天酚红棉线浸湿长度较第天下降了％第天较第天下降％。　　角膜荧光素染色和评分第天空白组、实验组、对照组均有小鼠角膜少许点状着色角膜评分各组未见统计学差异(＞)。实验组小鼠随着实验的进行角膜中央点状着色增加逐渐出现片状着色病变累及角膜各个象限以角膜中央为重。从第天起实验组角膜荧光素染色评分和第天相比明显升高(＜)。实验组第天角膜荧光素染色评分较第天升高了％。　　角膜虎红染色第天空白组、实验组、对照组均有只小鼠角膜虎红染色可见少量点状着色。实验组小鼠从第天开始角膜点状着色逐渐增加并且出现片状着色累计角膜个象限以中央和鼻侧角膜为重。　　泪液蕨类实验在各个检查时间点取空白组、对照组、实验组小鼠泪液在光学显微镜下进行泪液蕨类结晶图像分析。空白组、对照组在各个检查时间点均可观察到形态良好的蕨类物形成。实验组小鼠泪液结晶中的蕨类物从第天开始逐渐减少蕨类物之间的连接中断。第天以后显微镜下仅能观察到稀少的小蕨类物甚至完全消失。　　角膜上皮染色的光镜观察和角膜上皮厚度测量空白组和对照组小鼠角膜染色光镜观察可见上皮分层良好分～层基底部细胞排列呈柱状靠近角膜表面逐渐变成鳞状上皮细胞。实验组小鼠随实验进展基底层细胞部分缺失上皮细胞分层紊乱细胞层数减少出现空泡。第天和第天空白组、对照组、实验组小鼠的角膜上皮层厚度未见统计学差异(＞)。从第天起实验组较对照组和空白组角膜上皮层厚度明显减少(＜)。　　结膜上皮染色光镜观察和杯状细胞计数空白组和对照组小鼠的结膜上皮细胞排列整齐杯状细胞形态完整分布在上皮细胞间主要分布在穹隆部。实验组小鼠随实验进展上皮细胞排列紊乱甚至出现缺失杯状细胞形态不一致数量减少。在第天部分小鼠上方穹隆部杯状细胞完全缺失。　　扫描电子显微镜观察在第天用扫描电子显微镜观察空白组、对照组、实验组小鼠角膜上皮细胞。可见空白组和对照组上皮细胞形态呈多边形细胞间紧密连接细胞表面满布微绒毛。实验组小鼠角膜表面微绒毛丢失角膜表层上皮细胞破坏。　　结论　　用高渗盐水给小鼠点眼可以在小鼠角膜和结膜引起与干眼病患者类似的体征和组织病理学变化。　　用高渗盐水给小鼠点眼是一个简单的可靠重复性好的模型这个模型可以运用于干眼病发病机制和药物治疗的研究。　　泪液高渗透压可能在干眼病发病机制中起重要作用。