家蚕BmmY基因的克隆、表达与功能的初步研究.pdf

1、E(spl)my基因是果蝇中的剪切增强子，为Notch信号通路的下游调控靶基因，与果蝇的神经发育调节有关，目前该方面的研究主要在果蝇中进行，家蚕、小鼠等哺乳动物中也有发现Notch途径的保守靶基因序列，有关其编码的蛋白功能研究报道甚少。
　　 家蚕Bmmy(Bombyxmori，E(spl)my)是果蝇E(spl)my的同源基因，GenBank登录号为AB474582，该基因ORF框为747bp，编码249个氨基酸残基，预测分子

2、量为27.91kDa。经生物信息学分析发现该蛋白在体虱、大红斑蝶、火蚁、谷蛀虫和切叶蜂中的都有高度保守的同源序列。RT-PCR方法从化蛹第三天的蛹组织中克隆得到完整ORF片段，并克隆到T载体上，重组质粒转化E.coliTG1感受态细胞，挑选克隆培养后提质粒经PCR和酶切鉴定后，连接到表达载体pET-28a上，构建融合蛋白表达载体pET-28a-Bmmy，将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经提质粒、双酶切鉴定正确后，测序分析。阳

3、性克隆培养后经IPTG诱导表达，菌体总蛋白SDS-PAGE分析结果发现，在约35kDa的位置有一条特异性目的条带与预期值（Bmmy27.91kDa,加融合标签3.56kDa）相符，重组蛋白以包涵体的形式存在，Westernblot鉴定正确。用8M尿素溶解该蛋白，采用用Ni亲和层析的方法纯化，纯化蛋白以1mg/次的剂量皮下注射新西兰大白兔，免疫后采血制备多克隆抗体，ELISA检测其效价为1∶12800。用该抗体检测Bmmy蛋白在家蚕蛹、五

4、龄幼虫的组织分布及家蚕BmN亚细胞定位。通过Westemblot、实时荧光定量PCR和免疫组化发现Bmmy在家蚕不同发育时期的mRNA转录水平和蛋白表达水平有较大差异，蛹和卵的表达量较高，而在四龄幼虫和蛾中表达较少;在家蚕五龄幼虫各组织中头、皮、性腺、气门、脂肪体、丝腺中均较高表达，而在马氏管、血淋巴液和肠较少。但是各个时期荧光定量PCR结果显示该基因在五龄幼虫、蛾、一龄幼虫中的mRNA水平含量较高;各个组织荧光定量PCR结果显示该基因

5、在肠、皮、马氏管部位的mRNA水平含量较高，与Westemblot蛋白检测结果表达不完全一致，该蛋白表达可能存在翻译水平的调控;蛾四个部位免疫印迹显示该蛋白在胸部表达量最高。免疫组化结果显示该蛋白主要分布在五龄幼虫头部、丝腺、皮、性腺以及蛹的头部、肠道及体壁。亚细胞定位结果表明，该蛋白主要分布在细胞质中。分别采用不同时间和梯度浓度的Notch信号途径阻断剂DAPT处理家蚕BmN细胞，之后提取细胞的总RNA，用荧光定量PCR检测Bmmy基