人β-NGF基因载体的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达.pdf

1、郑硕士论文题目：作者姓名：学科门类：专业名称：导师姓名、职称：学位授予单位代码学号或申请号密级堂一论文人B—NGF基因载体的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达范波胜医学神经生理学章茜教授邢莹教授二oo五年五月二十B盏一郑州丈学2005毁欢士研究，#毕业论文(摘要)人BNGF基因载体的构建段其在兔骨鲢问充质干细胞中的表达真核表达载体并实现其在兔BMSCs中表达。方法1从人血白细胞中提取人基因组DNA，设计合适引物，采用PCR技术，扩增出

2、人BNGF前体基因并与pMDl8载体连接，经筛选得到重组质粒pMDl8BNGF，双酶切及测序进行鉴定。2将质粒pMDl8p—NGF用BamHI、＆oRV酶进行双酶切，获得人13一NGF基因片段，将其插入相同酶切的真核表达载体pcDNA30，构建基因重组真核表达载体pcDNA30p—NGF，双酶切对重组载体鉴定。3采集和培养兔BMSCs：应用密度梯度离心法分离兔骨髓中的单个核细胞(mononuclealcells，MNCs)，以1106c

3、ells／ml细胞接种于50ml的培养瓶内，置37℃，体积分数为5％C02，饱和湿度培养箱内培养。4采用脂质体转染技术，将己构建的pcDNA30BNGF质粒导入体外培养的兔BMSCs中，加入G418进行筛选，获得阳性细胞克隆，进行扩增培养。5分别应用RTPCR方法检测人0NGFfiIJ体基因的mRNA和ELISA方法对人BNGF蛋白进行检测。结果1经酶切电泳和DNA测序证实，PCR扩出的片段确为人6NGF莳体基因序列(约726bp)。2

4、成功构建重组真核表达载体pcDNA3013一NGF质粒。3采集和培养的兔BMSCs生长良好并稳定传代。4转染后经G418筛选得到抗性细胞克隆并进行培养。5在转染入pcDNA30—0一NGF质粒的兔BMSCs中，应用RTPCR可检测到人B。NGF前体基凼的mRNA，在其培养上清中应用ELISA方法可检测到人NGF蛋白。结论1成功克隆人日NGFfiF体基冈全长序列并成功构建重组真核表达载体pcDNA30一B—NGF质粒。2人B—NGF基因在