血管生成素1腺病毒载体的构建及其对内毒素性肺损伤炎症消退的影响.pdf

1、目的:克隆人血管生成素1基因（hAng1），采用AdMax包装系统构建含人血管生成素1的重组腺病毒质粒，为研究血管生成素1对急性肺损伤中炎症消退的作用奠定基础。方法:将hAng1Cdna克隆于真核表达载体Pdc315-EGFP，得到重组质粒Pdc315-EGFP-Ang1，采用位点特异性重组系统（Cre/Loxp）将Pdc315-EGFP-Ang1与Pbhg lox ΔE1,3 Cre辅助包装质粒共转染至HEK293细胞，生成带有Ang

2、1基因的重组腺病毒载体Ad-EGFP-Ang1，重组腺病毒质粒在HEK293细胞中扩增，氯化铯梯度离心纯化。检测转染的HEK293细胞中以及细胞培养上清中的Ang1蛋白表达。结果:经酶切鉴定和测序证实载体构建正确，病毒滴度为1.5×1012 PFU·Ml-1。Ad-EGFP-Ang1转染的HEK293细胞和细胞培养上清中均检测出Ang1蛋白。结论:带有hAng1Cdna的重组腺病毒载体构建成功，可用于对急性肺损伤炎症消退的影响的研究。<

3、br>　　 第二部分 气管内滴入脂多糖致小鼠内毒素性
　　 肺损伤模型的建立
　　 目的:气管滴入脂多糖复制小鼠急性肺损伤模型，为进一步探讨炎症反应过程奠定基础。方法:将20只SPF级雄性BALB/c小鼠（20-25g）随机分为对照组和脂多糖组，每组10只小鼠，麻醉后分别经气管插管滴入生理盐水（对照组）和脂多糖3 mg·kg-1（脂多糖组）。观察24小时死亡率、肺组织湿干重比、病理改变，肺泡灌洗液中的白细胞计数、中性粒

4、细胞计数和总蛋白浓度。 结果:脂多糖组小鼠死亡率33.3％，对照组没有小鼠死亡。脂多糖组肺组织病理评分、肺组织湿干重比、肺泡灌洗液中的白细胞计数、中性粒细胞计数和总蛋白浓度均高于对照组，（P=0.001）。结论:气管滴入脂多糖3 mg·kg-1成功模拟了ALI的过程，是进一步探讨炎症反应过程的可靠的ALI动物模型。
　　 第三部分 血管生成素1促进内毒素性肺损伤炎症消退
　　 目的:通过基因转染增加血清中血管生成素1（A

5、ng1）的浓度，探讨血管生成素1基因治疗对急性肺损伤炎症消退的影响。方法:SPF级BALB/c小鼠随机分为三组：对照组，GFP组和Ang1组。对照组：取4只小鼠，静脉注入空腺病毒载体，24小时后气管滴入生理盐水。GFP组和Ang1组气管内滴入脂多糖构建急性肺损伤动物模型前，分别经尾静脉注入空腺病毒载体（Ad-GFP，GFP组）和携带血管生成素1的腺病毒载体（Ad-GFP-Ag1，Ang1组）。经气管滴入脂多糖后4h、12h、24h、48

6、h、72h、96h处死小鼠，取肺泡灌洗液收集细胞，行细胞计数分类，并用流式检测中性粒细胞凋亡和被巨噬细胞吞噬情况。收集肺组织和肝脏组织以及血清，检测血管生成素1的基因和蛋白表达。检测肺泡灌洗液中的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子浓度变化。结果:LPS气管滴入后大量的白细胞浸润到肺组织和肺泡腔，早期以中性粒细胞为主，在48h白细胞和中性粒细胞达到最大值。Ang1预处理增加了ang1在肝脏的表达，分泌到血清中，减少了炎性细胞浸润并促进了中性粒细胞

7、的凋亡和吞噬，从而加速了中性粒细胞从组织的清除，同时，增加了肺泡灌洗液中的粒细胞单核细胞集落刺激因子浓度。结论:血管生成素1预处理促进了急性肺损伤炎症消退，这与其促进中性粒细胞的凋亡和巨噬细胞吞噬有关。
　　 1经颈透照明视下完成并证实小鼠气管插管成功，经气管插管滴入3mg·kg-1脂多糖可以成功复制ALI模型。
　　 2脂多糖3mg·kg-1气管滴入后48小时，肺组织炎症达高峰，随后进入炎症消退期。血管生成素1预处