东方鲎脂多糖结合蛋白和小鼠抗菌肽的基因克隆、表达及生物学功能研究.pdf

1、本文首次将FC基因在Tn细胞中成功地进行了表达,通过体外LPS中和活性及抑菌活性测定,证明表达产物具有良好的生物学活性.FC在Tn中表达不形成包涵体,易纯化,活性损失小.利用亲和层析柱纯化重组表达的FC,得到纯化的蛋白质为180ug/l,纯度达到94﹪.之后,为了深入了解FC中的不同结构域对其生物活性的影响,我们除了表达了FC全长片段外,还在Tn细胞中表达了FC的四个截短的片段CES123L,CES123, S123L 和S123,并比

2、较了这五个肽的体外抑菌活性及LPS结合活性.我们构建了PGEX-4T-2- Bin1b大肠杆菌表达质粒,并成功地在大肠杆菌中表达出GST-Bin1b融合蛋白质.GST-Bin1b 融合蛋白经thrombin酶切后,产生了N端融合了thrombin酶切位点的氨基酸的Bin1b 肽,而不是N端为豆蔻酰化的甘氨酸的Bin1b 肽, 这个结果为我们研究N端豆蔻酰化的甘氨酸是否为Bin1b肽抑菌活性所必需提供了条件.抑菌实验发现由GST-Bin1

3、b 融合蛋白水解的到的Bin1b肽能够显著抑制细菌的生长,这个结果表明N端豆蔻酰化的甘氨酸对于Bin1b 的抑菌活性不是必需的,这为通过基因工程手段获得大量的Bin1b生物活性肽奠定了基础.Bin1b在大肠杆菌中的表达量不高,仅为1.3mg/l.还不能达到大量生产的要求.为了能够获得大量的Bin1b蛋白质,我们尝试在大肠杆菌中表达Bin1b的串联产物.实验结果表明串联两个Bin1b单元的融合体能够成功地在大肠杆菌中获得表达,2×Bin1