酿酒酵母乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶以及两种水生动物抗菌肽的表达和酶活分析.pdf

1、1乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶的表达及酶学性质分析
　　 酿酒酵母中的乙醇脱氢酶2催化乙醇氧化生成乙醛,乙醛脱氢酶催化乙醛氧化生成乙酸。本研究从酿酒酵母基因组中分别克隆、表达乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶,对其进行了纯化,然后体外测定酶活及酶动力学分析。为研发新型解酒食品提供理论基础。主要内容如下:
　　 1.1从酿酒酵母基因组DNA扩增获得6种酶的基因并构建了6个表达载体,pRX2-ADH2、pRX2-ALDH6、pRX2-AL

2、DH2、pRX2-ALDH3、pRX2-ALDH4和pRX2-ALDH5,分别转化E.coli BL21,通过乳糖自诱导表达目的蛋白,6种酶得到成功表达,但ADH2和ALDH4主要以包涵体形式表达；
　　 1.2重新构建3个表达载体,pGEX-ADH2,pBAD-ADH2和pBAD-ALDH4,优化表达条件,初步判断ALDH4以可溶性形式表达,ADH2仍然以包涵体形式表达；
　　 1.3采用Ni-NTA His.Bind

3、 Resin亲和层析柱纯化带有6His·Tag的重组蛋白,纯化后经SDS-PAGE检测目的蛋白的纯度约为90％；采用Bradford蛋白测定法测得ADH2、ALDH6、ALDH2、ALDH3和ALDH5浓度分别为2.07mg／mL,1.624mg／mL,0.6635 mg／mL,0.7596 mg／mL和0.9615 mg／mL；
　　 1.4体外测定复性后的ADH2和纯化得到的乙醛脱氢酶活性,通过紫外可见分光光度计测定产物β-

4、NADH和β-NADPH的生成量,结果显示ADH2、ALDH6、ALDH2、ALDH3和ALDH5的比活力分别约为2.107U／mg,16.86U／mg,1.416U／mg,1.566U／mg和2.742U／mg;
　　 1.5研究温度、pH值和金属离子对ADH2和乙醛脱氢酶活力的影响。得出ADH2、ALDH6、ALDH5、ALDH2和ALDH3最适温度分别为45℃,30℃,37℃,37℃和50℃,最适pH值分别为7.4,7.4

5、,8.0,7.4和8.5。
　　 1.6研究ADH2和乙醛脱氢酶酶动力学性质。ADH2对NAD+和乙醇的Km分别为1.1mM和120μM,ALDH6和ALDH5对NADP+和乙醛的Km分别为(101μM,42μM)和(664μM,129μM),ALDH2和ALDH3对NAD+和氨基丙醛的Km分别为(471μM,17.5μM)和(410μM,8.6μM)。
　　 2两种抗菌肽的克隆、表达及活性分析
　　 将两种水生

6、动物分泌的抗菌肽基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1两个融合蛋白表达载体,转化至表达宿主菌Escherichia coli Rosetta中进行表达,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。融合蛋白经复性、酶切处理获得抗菌Y18和CEC1。抑菌实验结果表明,融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E.coli DH5α、Bacillus subtilis