真菌果胶甲基酯酶的重组制备及性质表征.pdf

1、果胶是一类富含多聚半乳糖醛酸的天然高分子化合物，是植物细胞壁的重要组成部分。果胶甲基酯酶能催化果胶的半乳糖醛酸链上的甲氧基去甲氧基化，因此具有降解果胶的活性。黑曲霉来源的果胶甲基酯酶在果汁生产中可以有效控制果汁的澄清和浑浊，但黑曲霉能产生多种果胶酶，这些酶的生化性质相似，为果胶甲基酯酶的纯化带来困难，重组制备黑曲霉果胶甲基酯酶是一种可行、有效的方法。另一方面，黄曲霉分泌的果胶甲基酯酶是黄曲霉侵染植物时的致病因子之一，抑制该酶活性可控制黄

2、曲霉对作物的侵染。另外，真菌来源的果胶甲基酯酶的催化机制与细菌及植物来源的不同，有必要研究真菌果胶甲基酯酶的结构和功能，但真菌果胶甲基酯酶的晶体结构还未见报道。 因此，本论文以黑曲霉果胶甲基酯酶和黄曲霉果胶甲基酯酶为研究对象，分别对这2个酶进行了重组制备及性质表征。
　　(1)黑曲霉果胶甲基酯酶的克隆表达、分离纯化及性质表征
　　克隆了黑曲霉果胶甲基酯酶基因，利用组成型表达载体pGAPZα在毕赤酵母中成功地分泌表达了

3、该酶，而且无需甲醇诱导，避免了工业上甲醇诱导的不便。利用HiTrapTMQXL阴离子交换柱层析和Resource S阳离子柱层析分离纯化得到电泳纯蛋白，其中比活力为342 U/mg，蛋白纯化活力回收率为28％。对纯化后的重组酶进行了性质分析，得到Vmax为1.376 mmol/(min×mg),Km为0.19％ pectin(w/v)≈8.6mmol/L,Kcat为8.26×103 S-1,最适温度为50℃，最适pH为4.7，且该酶在3

4、0-50℃、pH4.0-6.0稳定性较好。该酶能够被K+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Ni2+离子抑制活性，Na+对酶活力没有影响。
　　(2)黄曲霉果胶甲基酯酶的重组表达、分离纯化及其抑制剂筛选
　　利用载体pPIC9在毕赤酵母GS115中表达了黄曲霉果胶甲基酯酶基因。通过亲和色谱层析和离子交换两步纯化，得到了电泳纯的重组黄曲霉果胶甲基酯。对该酶进行了性质分析，其最适pH为4.8，最适温度为55℃，同时发现该酶对中等甲酯

5、化度果胶表现出更强催化活性。通过抑制剂筛选，发现带有五倍子酸基团的植物多酚(EGCG)和绿茶提取物多酚(PP60)对该酶有抑制活性。
　　(3)黑曲霉果胶甲基酯酶的原核表达及结晶条件研究
　　黑曲霉果胶甲基酯酶和黄曲霉果胶甲基酯酶在毕赤酵母细胞中的表达，都存在不均一性的糖基化现象，糖基化不均一的蛋白质很难形成结晶，所以采用在大肠杆菌原核系统里表达这2个酶。研究发现黄曲霉果胶甲基酯酶在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，而黑曲霉果胶