2023年全国硕士研究生考试考研英语一试题真题(含答案详解+作文范文)_第1页
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文档简介

1、CD1d是一种MHCI类分子类似物,与MHCI类分子主要提呈抗原肽不同,CD1d主要提呈脂类、糖脂类抗原给自然杀伤性T细胞(NKT)。作为NKT细胞的配体,CD1d多聚体为NKT细胞的相关研究提供了鉴定与功能调控的手段。本研究拟制备人CD1d二聚体(hCD1d二聚体),为后续深入研究NKT细胞奠定基础。本研究主要内容包括:
  ⑴pFastBacTMDual+[β2m+CD1d/IgG1-Fc]昆虫杆状病毒表达载体的构建。为了构建

2、pFastBacTMDual+[β2m+CD1d/IgG1-Fc]表达质粒,选用本课题组前期已经建立的pFastBacTMDual+[β2m]质粒作为载体,该载体中P10启动子下游已经重组入正确的人β2m编码基因。应用人CD1d及IgG1-Fc特异性引物分别从人PBMC中扩增hCD1d(α1-α3)与IgG1-Fc(CH1-CH3区)编码基因。通过酶切位点将hCD1d与 IgG1-Fc融合基因插入到 pFastBacTMDual+[β2

3、m] Ph启动子下游,获得pFastBacTMDual+[β2m+CD1d/IgG1-Fc]表达质粒。经过特异性引物PCR、限制性内切酶酶切和DNA碱基序列测定证实构建的质粒正确插入了目的基因。
  ⑵hCD1d二聚体的表达及鉴定。将携带目的基因的pFastBacTMDual+[β2m+CD1d/IgG1-Fc]质粒通过转座作用转入杆状病毒载体,并转染到草地贪夜蛾sf9细胞中。转染后5天收集细胞培养上清,此上清中含有可表达hCD1

4、d二聚体的杆状病毒颗粒。利用此上清继续感染细胞,对感染每一代病毒的细胞上清进行hCD1d二聚体水平检测,结果显示感染第四代病毒的细胞上清中hCD1d二聚体表达量最高。收集感染第四代病毒的细胞上清,用特异性的抗体进行ELISA及Western-Blot检测鉴定。结果证实获得具有正确构象与分子量的hCD1d二聚体。
  ⑶hCD1d二聚体的纯化。由于hCD1d二聚体含有IgG1-Fc片段,本研究利用金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)对hC

5、D1d二聚体进行纯化。然而实验显示传统的洗脱液(pH4.5的0.1M甘氨酸)不能有效的洗脱hCD1d二聚体。比较pH2.5的0.1M甘氨酸、pH2.5的0.5M甘氨酸、pH2.5的1M甘氨酸、pH2.5的0.1M乙酸、pH1.9的0.1M盐酸和pH2.5的0.1M柠檬酸等六种不同洗脱液洗脱效果,结果显示pH2.5的0.1M柠檬酸洗脱能够较好的浓缩纯化hCD1d二聚体。
  ⑷HLA-A2二聚体与hCD1d二聚体在纯化过程中的构象稳

6、定性分析。HLA-A2为经典MHC I类分子,本室之前构建表达的HLA-A2二聚体是HLA-A2与IgG1-Fc的融合蛋白。通过比较HLA-A2二聚体与hCD1d二聚体在纯化过程中构象的改变,发现在SPA亲和层析过程中,大部分纯化的hCD1d二聚体中hCD1d与β2m可以维持完整构象(完整构象率%:71.4%±30.1%,n=3),而大部分纯化的HLA-A2二聚体中β2m脱落、导致构象改变(完整构象率%:13.7%±13.7%,n=2)

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