Na+-HCO3-共转运体NBCn1与NBCn2表达产物多样性及功能研究.pdf

1、SLC4家族蛋白是一类重要的酸碱调控蛋白，对维持机体酸碱平衡、调控细胞内外pH和促进HCO3-的重吸收或者分泌具有重要的作用。SLC4家族共含有十个成员。其中NBCn1和NBCn2分别由Slc4a7和Slc4a10编码，都是电中性的Na+/HCO3-共转运蛋白。NBCn1和NBCn2在基因结构及蛋白一级序列上有着很高的同源性。
　　每个 SLC4家族基因都能够通过选择性转录或者选择性剪接产生多种剪接异构体。选择性转录和选择性剪接对

2、SLC4家族蛋白的表达和转运功能具有重要的调控作用。在此前的研究中，已经发现Slc4a7含有3个可选择性剪接外显子cassette I、cassette II和cassette III，并且在人类组织中发现了NBCn1-A和NBCn1-F，在小鼠和大鼠组织中发现了NBCn1-B/C/D/E。人类NBCn1的Nt（N terminus，Nt）以11个特异性氨基酸残基为起始，称为MERF-NBCn1，而啮齿类NBCn1的N端以16个特异性氨

3、基酸残基为起始，称为MEAD-NBCn1。在本研究开展之前并不知道人类基因组能否产生MEAD-NBCn1，小鼠组织能否产生MERF-NBCn1，也不清楚NBCn1的选择性剪接元件对各个NBCn1剪接异构体表达和转运功能的影响。
　　在本研究中，我们首次发现小鼠基因组既能够产生MEAD-NBCn1，又能够产生MERF-NBCn1。此外，我们发现了两个新的可选择性剪接外显子exon3和exon11（又称cassette IV）。根据小

4、鼠Slc4a7基因含有的2个5，UTR和5个可选择性剪接外显子，我们共鉴定了12个新的NBCn1剪接异构体。在这12个NBCn1剪接异构体中，有10个是全长型MEAD-NBCn1和MERF-NBCn1；1个是全长型NBCn1-R，NBCn1-R的Nt以21个特异性氨基酸起始，称为MIPL-NBCn1；1个是NBCn1-Q，相比全长型MERF-NBCn1而言，NBCn1-Q缺失了Nt115个氨基酸残基，称为MDEL-NBCn1。通过电生理

5、学手段和生物素酰化方法分析NBCn1剪接异构体在爪蟾卵母细胞中的转运活性和膜蛋白表达，我们发现NBCn1的特异性Nt和可选择性剪接元件能够影响NBCn1的转运功能和上膜能力。MEAD型Nt倾向于提高而cassette IV倾向于减少NBCn1的上膜表达，cassette II、cassette III和cassette IV都倾向于增强NBCn1的单分子转运活性。当在爪蟾卵母细胞中表达时，MIPL-NBCn1即NBCn1-R能够表现出正

6、常的Na+/HCO3-转运活性，而MDEL-NBCn1即NBCn1-Q的Na+/HCO3-转运活性较为微弱，但是NBCn1-Q仍能表现出明显的Na+电导活性。
　　与Slc4a7基因类似，Slc4a10也能够通过选择性转录和选择性剪接产生多种转录本。我们课题组的前期western blot结果表明，MCDL-NBCn2在大鼠肾脏中的蛋白表达非常丰富，但是根据已有的cDNA序列设计引物，无法扩增得到MCDL-NBCn2 cDNA全长

7、，只能够得到起始密码子“ATG”下游片段。因此我们猜测，在大鼠肾脏中，Slc4a10的MCDL-NBCn2转录本很有可能含有一个新的5，UTR，并且MCDL-NBCn2的转录受到一个新的启动子调控。
　　通过5，RACE和荧光素酶活性分析，我们发现大鼠 Slc4a10基因含有一个新的启动子（P2），从此启动子进行转录，大鼠Slc4a10既能够产生MCDL-NBCn2，又能够产生Nt截短的NBCn2剪接异构体。Nt截短的NBCn2异

8、构体以“MHAN”为起始，称为MHAN-NBCn2。当在neuro-2a细胞中外源表达时，MHAN-NBCn2几乎全部滞留在细胞质中。通过一系列的Nt截短，我们发现NBCn2的Nt氨基酸序列“HDLFTEL”对 NBCn2的正常上膜具有重要的作用。当全长型 NBCn2与 Nt截短型 NBCn2在neuro-2a细胞中共表达时，全长型NBCn2能够显著增强Nt截短型NBCn2的上膜表达。免疫共沉淀和双分子荧光互补实验表明在 neuro-2

9、a细胞中，全长型 NBCn2与Nt截短型NBCn2能够形成异源二聚体。最后，我们的实验结果显示独立的Nt结构域仍然能够与Nt截短型NBCn2相互作用并增强Nt截短型NBCn2在neuro-2a细胞中的上膜表达。
　　通过比较分析SLC4家族的NBCn1、NBCn2和NBCe2的Nt截短蛋白在neuro-2a细胞中的定位，结合我们在本研究中和别的课题组的电生理研究成果，我们发现NBCn1、NBCn2和NBCe2的Nt可变区1（var