小鼠体细胞核移植中不同去核方法及融合和培养条件对重构胚胎发育的影响.pdf

1、小鼠体细胞核移植技术不仅可以为研究动物胚胎发育、细胞和组织分化、基因表达调控、核质相互作用提供技术平台，而且在建立人类疾病动物模型方面也有着重要的作用和意义。本实验以B6D2F1品系小鼠的胎儿成纤维细胞和卵母细胞作为核、质供体，通过不同去核方法、融合方案、体外培养条件以及PEG/DMSO和TSA等试剂的应用，对小鼠体细胞核移植重构卵去移核后的存活情况、电融合情况和激活后重构胚的着床前发育情况进行比较，筛选合适的实验条件，为本实验室小鼠体

2、细胞核移植技术的建立和应用打下基础。结果如下： 一、持卵方法、去核针口径对小鼠卵母细胞去移核效果的影响：(1)以改进的双持卵针法去移核后重构卵的存活率(82.05﹪)极显著高于传统的单持卵针法(22.35﹪)(P＜0.01)；(2)以14～16μm内径组去核针去移核后重构卵存活率为80.77﹪，显著高于10～12μm组和20～22μm组(P＜0.05)。 二、PEG/DMSO对供核细胞的处理、不同的融合液、融合电参数

3、和细胞代次对融合率的影响：(1)以PEG/DMSO对供核细胞预处理5分钟后所得融合率显著高于同条件下未处理组(51.11﹪vs25.64﹪)(P＜0.05)；(2)融合液中含0.1g/LPVA的各组融合率均高于无PVA组；重构卵在甘露醇浓度为0.32mol/L的融合液中的融合率(48.21﹪)高于其他甘露醇浓度组的融合率(27.78﹪，41.67﹪和30.11﹪)；(3)针状电极融合槽的融合率(42.31﹪，43.13﹪)高于其他参数条

4、件相同时平行丝状电极融合槽组(30.43﹪，33.33﹪)，其中又以在2000V/cm，20μs，2个脉冲时，交流电预处理30秒组最高(43.13﹪)；(4)供核细胞传代一次后融合率随着传代次数的增加而下降。 三、TSA和培养系统对重构胚体外发育率的影响：(1)组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatinA能够提高重构胚的发育率；(2)不同的体外培养系统(CZBG，KSOM，KSOM+Vero饲养层细胞)中，以KSOM体系培

5、养重构胚时卵裂率(39.06﹪)高于其它组(34.14﹪，35.90﹪)，而KSOM+Vero饲养层培养体系中桑葚胚发育率(15.38﹪)高于其它组(8.54﹪，12.50﹪)。 实验结果表明，本实验室采用双持卵针法，内径14～16μm去核针可以获得较高的去移核后重构卵存活率；使用针状电极融合槽，当融合液中甘露醇浓度为0.32mol/L，并添加PVA时，在2000V/cm，20μs，2个脉冲，交流电预处理30s条件下可以得到相