转染hTERT基因建立人永生化神经干细胞系的实验研究.pdf

1、神经干细胞(Neuralstemcells,NSCs)是指神经系统内具有多潜能、自我复制、自我更新、自我维持并能分化成神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞等特点的细胞。自1992年Reynolds和Weiss在成年小鼠纹状体分离出神经干细胞以来，现已从胚胎期神经系统中的多个部位，包括大脑皮层、海马、纹状体、嗅球、脑室沿线包括侧脑室、第三脑室和第四脑室、间脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜中分离得到NSCs或比NSCs具有更明确发展方向的神经祖细

2、胞。在成体内也存在两个NSCs聚集区：侧脑室壁的脑室下层(subventricularzone，SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(subgranularzone，SGZ)。 目前神经干细胞的体外分离、培养和扩增技术已较成熟，并且在诱导因子的作用下神经干细胞在体外可分化为几种终末的神经细胞。 研究表明，神经干细胞在体外培养需要有促有丝分裂原的参与，如表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或/和碱性

3、成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)。鼠来源的神经干细胞在以上条件下分裂增殖速度较快，约1d分裂1次，而人来源于的神经干细胞分裂一次则需7～14d。在体外经过有限次的传代后，随着端粒长度的缩短，细胞就会停止分裂增殖，发生衰老和死亡，这就限制了其应用。 基因工程化的人神经干细胞，由于其克隆性、稳定性及快速增殖能力，可能更适合于细胞及分子生物学的研究。有学者提出了永生化神经干细胞的概

4、念，永生化是指通过基因操作使细胞总是处于连续的细胞周期内，从而阻止了其进一步分化。通常采用通过不同载体将编码癌基因蛋白的基因转导入胚胎神经干细胞中的方法来获得永生化神经干细胞，目前以myc及SV40大T抗原应用最为广泛。国外已有人采取不同的方法建立了人永生化神经干细胞系，如取自胚13周人海马组织而建立的C10、JA3细胞系；胚15周人端脑的H6细胞系；胚10.5周人端脑的HNSC.100细胞系等，以上细胞系均用v-myc基因转染神经干细

5、胞而来。永生化神经干细胞除具有神经干细胞的一般特点外，尚有以下优点：(1)它们在体外可以自我更新，并能大量增殖；(2)能通过基因操作使细胞稳定地表达报告基因及治疗基因；(3)可以分离出单个细胞克隆；(4)通过加入了外源基因而获得的永生化神经干细胞，在体内仍然能像神经干细胞一样具有多向分化潜能。 细胞永生化机制，在于转入这些基因后，激活了体内端粒酶活性，从而使细胞获得了无限增殖能力，而达到永生化。在调节端粒酶活性的因素中，端粒酶催

6、化亚单位(humantelomerasereverseranscriptase，hTERT)是其限速因素，国外已有人采用hTERT转染不同体细胞，获得永生化细胞的报道。因此，我们用hTERT基因转染神经干细胞，以期获得永生化的神经干细胞系，为进一步研究神经干细胞提供不断的细胞供源。 在本课题中，我们成功分离、鉴定了孕10～14周流产的人胚胎大脑皮层来源的神经干细胞，在将hTERT基因成功构建到逆转录病毒载体(PLXSN)上后，将

7、PLXSN-hTERT转染人胚神经干细胞，获得了人胚永生化神经干细胞系，并将其移植到裸鼠体内，证实不具有成瘤性，应用安全。我们获得的主要结果如下：1.分离、培养、鉴定了孕10～14周人胚胎脑皮层来源的神经干细胞。 2.构建并扩增、纯化及鉴定了PLXSN-hTERT。 3.通过包装获得了PLXSN-hTERT逆转录病毒全病毒，并证实其在靶细胞中成功表达。 4.病毒上清可有效地转染神经干细胞，转染后神经干细胞端粒酶活

8、性检测明显升高，且持续表达；同时hTERTmRNA的表达升高，但其表达水平与端粒酶活性不平行，转染后早期升高，继之下降并维持在一定水平，因此hTERTmRNA不能作为端粒酶活性检测指标。 5.永生化神经干细胞仍然保持未分化状态，能够自我更新、自我维持并具有多分化潜能，其生长速率明显加快，分裂增殖能力明显增强。 6.染色体分析及裸鼠移植试验显示hTERT转染神经干细胞具有正常的二倍体，无致瘤性。 总之，本实验成功地